Pembahasan Singkat Beberapa Metode Unik Serat Berongga dalam Pemurnian Tubuh Inklusi

Badan Inklusi (IB) adalah partikel protein berdensitas tinggi dan tidak larut yang terbungkus dalam membran yang terbentuk ketika gen asing diekspresikan dalam sel prokariotik, terutama pada Escherichia coli. Jika diamati di bawah mikroskop, IB merupakan daerah dengan refraksi tinggi, yang jelas berbeda dengan komponen lain di sitoplasma.

Pembentukan tubuh inklusi relatif kompleks, berkaitan dengan laju produksi protein di sitoplasma, konsentrasi peptida baru yang tinggi, dan waktu pelipatan yang tidak cukup, sehingga membentuk agregat protein amorf. Badan inklusi pada dasarnya terdiri dari protein, lebih dari 50% di antaranya merupakan produk kloning. Struktur utama produk ini sepenuhnya benar, tetapi konfigurasi tiga dimensinya salah, sehingga tidak ada aktivitas biologis. Ukuran tubuh inklusi adalah 0.5-1μm, tidak larut dalam air, hanya larut dalam denaturant seperti urea, guanidin hidroklorida, dll.

Pada E. coli, badan inklusi dapat terjadi di dua lokasi sel: sitoplasma dan sitoplasma perifer. Lokasi dan karakteristik badan inklusi dalam sel bergantung pada bagaimana protein diekspresikan.

Inklusi dalam sitoplasma E. coli umumnya memiliki diameter berkisar dari {{0}}.2 hingga 1,5μm, dan protein yang berbeda memiliki diameter yang berbeda, seperti ukuran interferon adalah 0,811μm, dan ukuran prorennet adalah 1,281μm. Dalam beberapa kasus, diameter beberapa badan inklusi lebih besar dari diameter E. coli, sehingga menyebabkan E. coli menonjol. Secara umum, sebuah sel hanya mempunyai satu badan inklusi.

 

Pemurnian tubuh inklusif

 

Proses pemurnian tubuh inklusi secara umum adalah:

Penghancuran sel:

Teknologi umum penghancuran sel adalah: penghancuran jaringan berkecepatan tinggi, homogenisasi homogenizer kaca, perlakuan ultrasonik, metode pembekuan-pencairan berulang, perlakuan kimia (umumnya menggunakan perlakuan lisozim).

 

Inklusi sabun mandi:

Badan inklusi adalah partikel padat tidak aktif yang dibentuk oleh aglutinasi protein intraseluler yang diekspresikan oleh bakteri, yang biasanya ada dalam bentuk amorf dan tidak larut. Pada badan inklusi, protein target sebenarnya hanya sekitar 50%, dan sisanya mengandung lipid, lipopolisakarida, asam nukleat dan heteroprotein, yang terikat pada badan inklusi dan mempengaruhi renaturasi protein tubuh inklusi. Oleh karena itu, pencucian sebelum denaturasi merupakan langkah yang sangat diperlukan.

Selain itu, pencucian badan inklusi bermanfaat untuk meningkatkan hasil pelipatan ulang protein rekombinan. Dengan menghilangkan pengotor, hambatan dalam proses renaturasi dapat dikurangi, sehingga protein dapat terlipat lebih efisien dan tersusun dengan benar, sehingga meningkatkan aktivitas dan fungsi protein‌.

Pencucian umumnya menggunakan kurang dari 1% deterjen netral, seperti Tween, Triton, Urea dan NP40 plus EDTA dan zat pereduksi 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoetanol diulang berkali-kali, karena kapasitas pencucian deterjen ditingkatkan dengan meningkatnya kekuatan ionik larutan, dalam pencucian badan inklusi dapat ditambahkan NaCl untuk meningkatkan kekuatan ioniknya.

Badan inklusi dapat digunakan untuk menghilangkan komponen lain dari larutan pemecahan sel dengan sentrifugasi atau filtrasi, yang keduanya memanfaatkan sifat fisik badan inklusi yang berbeda.

 

Sentrifugasi:

Protein badan inklusi jauh lebih padat dibandingkan dengan volume fragmen sel yang sama, sehingga badan inklusi dapat dipisahkan dari bagian sel lainnya melalui sentrifugasi. Sentrifugasi berkelanjutan adalah operasi yang paling sering digunakan untuk memperoleh badan inklusi dalam produksi industri. Karena kepadatan fragmen sel lebih kecil dibandingkan dengan badan inklusi, maka laju sedimentasi juga lebih kecil dibandingkan dengan badan inklusi. Suspensi dan sentrifugasi terus menerus dapat menyentrifugasi sebagian besar badan inklusi, sementara fragmen sel dihilangkan secara bertahap.
Filtrasi (filtrasi aliran tangensial): Karena perbedaan ukuran molekul badan inklusi dan protein terlarut, metode filtrasi dapat digunakan, yang dapat mengurangi biaya pengoperasian dan memudahkan peningkatan skala. Filtrasi aliran tangensial (TFF) didorong oleh perbedaan tekanan transmembran. Zat dan pengotor yang lebih kecil dari ukuran pori membran melewati membran, sedangkan pengotor seperti sel dengan partikel lebih besar terperangkap. Bukaan membran yang umumnya digunakan untuk pencucian filtrasi adalah 0.1μm. Mikrofiltrasi aliran tangensial serat berongga dapat secara langsung menangani kandungan bahan cair padat yang tinggi, langkah yang lebih sedikit, pengoperasian yang sederhana, membran dapat digunakan berulang kali melalui pembersihan, mengurangi investasi peralatan dan biaya pengoperasian, sejalan dengan persyaratan produksi otomatis modular.

 

Berikut ini adalah kasus aplikasi untuk penyertaan sabun mandi menggunakan kolom serat berongga Guidling.

Kami menggunakan serat berongga berukuran 94cm2 0.1-0.45μm untuk mengonsentrasikan 250mL cairan (berat molekul protein target 17kd). Dalam keseluruhan proses pencucian, tingkat pemulihan protein target dan penipisan fluks membran diselidiki.

0-71menit adalah proses konsentrasi, 71-224menit adalah proses pencucian dan penyaringan. Selama keseluruhan proses mikrofiltrasi, TMP meningkat secara bertahap, kecepatan masuk cairan tetap tidak berubah, dan fluks material rata-rata adalah 12LMH.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa protein target terperangkap seluruhnya, dan tingkat pemulihan protein target lebih dari 90%. Kolom serat berongga pemandu stabil dan cocok untuk aplikasi ini.

 

Pembubaran badan inklusi:

Badan inklusi umumnya dilarutkan dalam kondisi zat denaturasi urea atau guanidin hidroklorida, dan protein badan inklusi terlarut didenaturasi sepenuhnya, yaitu, kecuali struktur primer dan ikatan kovalen dipertahankan, semua ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik dihancurkan, dan hidrofobik rantai samping terbuka seluruhnya.

Urea dan guanidin hidroklorida merupakan denaturant berkekuatan sedang, yang mudah dihilangkan melalui dialisis dan ultrafiltrasi. Konsentrasi umum urea 8-10M, guanidin hidroklorida 6-8M. Pelarutan urea memiliki keunggulan non-ionisasi, netral, biaya rendah, penghilangan protein setelah renaturasi tidak akan menyebabkan pengendapan protein dalam jumlah besar, dan badan inklusi terlarut dapat dimurnikan dengan berbagai metode kromatografi, sehingga telah banyak digunakan. .

 

Pelipatan ulang protein tubuh inklusi:

Protein rekombinan terlarut harus dilipat dengan benar untuk membentuk protein fungsional. Teknik renaturasi meliputi pengenceran larutan protein hingga mendekati netral, penghilangan denaturant, renaturasi kolom, dan kromatografi filtrasi gel. Diantaranya, mengencerkan larutan protein hingga mendekati netral dan menghilangkan denaturant merupakan metode renaturasi klasik yang umum, terutama metode renaturasi pengenceran yang memiliki tingkat pemanfaatan tertinggi.

Penghapusan denaturant:

Dialisis: Keuntungannya adalah volumenya tidak bertambah, dan laju penghilangan denaturant dikendalikan dengan secara bertahap mengurangi konsentrasi cairan permeabel eksternal, namun membutuhkan waktu lama dan mudah untuk membentuk agregat protein tidak aktif, yang tidak cocok untuk operasi skala besar dan tidak dapat diterapkan pada skala produksi.

Ultrafiltrasi (TFF): mudah untuk mengontrol kecepatan dialisis, baik dalam penelitian dan pengembangan, uji coba atau produksi, dapat menghilangkan denaturant (perubahan cairan + konsentrasi) melalui ultrafiltrasi (TFF).

 

Pemurnian protein tubuh inklusi:

Metode pemurnian protein setelah renaturasi serupa dengan pemurnian protein terlarut, yaitu kromatografi penukar ion, kromatografi filtrasi gel, kromatografi afinitas, pengendapan garam amonium sulfat, dll.

Badan inklusi tidak memiliki aktivitas biologis, tidak perlu khawatir kehilangan aktivitas protein, dan ekspresi dalam jumlah besar tidak akan menyebabkan kematian sel, dan memaksimalkan resistensi terhadap serangan protease. Serat berongga Jiuling dapat diterapkan secara fleksibel dalam proses pemurnian hilir badan inklusi. Pada langkah pencucian badan inklusi, kinerjanya sangat baik, dibandingkan dengan pencucian sentrifugal, penggunaan serat berongga mikrofiltrasi teknologi sembilan usia untuk pencucian filtrasi aliran tangensial dapat sangat mempersingkat waktu proses, dan tingkat pemulihan umum dapat mencapai lebih dari 90%. Serat berongga Jiuling juga dapat digunakan dalam langkah renaturasi protein badan inklusi. Kekeruhan cairan umpan yang disaring oleh serat berongga mikrofiltrasi akan berkurang secara signifikan, dan tingkat perolehan protein akan tinggi; Penggunaan serat berongga ultrafiltrasi tidak hanya dapat menghilangkan denaturant, tetapi juga mempersingkat waktu pemuatan sampel kromatografi, sehingga menghemat waktu, mengurangi volume pengisi dan mengurangi biaya produksi. Tingkat pemulihan serat berongga mikrofiltrasi/ultrafiltrasi bervariasi menurut bahan yang berbeda, dan tingkat pemulihan secara umum dapat mencapai 90-95%.

Guidling Technology menyambut Anda untuk meminta alat tes untuk tinjauan terkait.

 

Tentang Panduan

Guidling Technology adalah perusahaan teknologi tinggi nasional yang berfokus pada biofarmasi, kultur sel, pemurnian dan konsentrasi biomedis, diagnosis, dan cairan industri. Kami telah berhasil mengembangkan perangkat filter sentrifugal, kaset ultrafiltrasi & mikrofiltrasi, filter virus, sistem TFF, filter kedalaman, serat berongga, dll. Yang sepenuhnya memenuhi skenario penerapan biofarmasi, kultur sel, dan sebagainya. Membran dan filter membran kami banyak digunakan dalam konsentrasi, ekstraksi dan pemisahan pra-filtrasi, mikrofiltrasi, ultrafiltrasi, dan nanofiltrasi. Berbagai lini produk kami, mulai dari filtrasi laboratorium kecil sekali pakai hingga sistem filtrasi produksi, pengujian sterilitas, fermentasi, kultur sel, dan banyak lagi, memenuhi kebutuhan pengujian dan produksi. Guidling Technology berharap dapat bekerja sama dengan Anda!