Analisis Lengkap Proses Pembuatan Obat MRNA: Bagaimana Teknologi TFF Mengatasi Tantangan Pemurnian
Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi mRNA telah mencapai kemajuan terobosan di bidang biofarmasi, menunjukkan potensi penerapan yang luar biasa, khususnya dalam vaksin dan terapi gen. Keberhasilan pengembangan vaksin mRNA tidak hanya memberikan solusi baru untuk pencegahan dan pengendalian penyakit menular, namun juga mendorong kemajuan dalam imunoterapi kanker dan pengobatan yang dipersonalisasi. Sebagai produk terapeutik kelas baru,-produksi mRNA skala besar sangatlah menantang, yang melibatkan kontrol stabilitas RNA, penghilangan sisa enzim dan reaksi-produk sampingan, pertukaran buffer, dan pencapaian tingkat pemulihan-kemurnian yang tinggi, yang semuanya memerlukan teknologi manufaktur dengan solusi-yang disetujui oleh peraturan.
Proses pembuatan vaksin atau terapi mRNA terutama dibagi menjadi tiga tahap: penyiapan larutan massal DNA plasmid, penyiapan larutan massal mRNA, dan penyiapan produk obat mRNA-LNP.
Diagram Alir Proses Pembuatan Obat mRNA
Filtrasi aliran tangensial (TFF), sebagai-teknologi pemisahan membran yang sudah mapan, diterapkan secara luas dalam pembuatan mRNA karena kemampuan pengayakan molekuler yang-efisiensi tinggi, pertukaran buffer yang terkendali, dan karakteristik tegangan geser yang rendah. Berdasarkan desain modul membran, konfigurasi TFF yang umum mencakup kaset-lembar datar dan modul serat-berongga. Selain itu, pemisahan membran yang digerakkan oleh tekanan di TFF dapat diklasifikasikan menjadi mikrofiltrasi (MF), ultrafiltrasi (UF), nanofiltrasi (NF), dan osmosis balik (RO) sesuai dengan ukuran pori membran, dengan selektivitas yang semakin meningkat.
TFF memainkan peran penting dalam berbagai tahap pembuatan obat mRNA, termasuk persiapan sebagian besar DNA plasmid, produksi massal mRNA, dan formulasi akhir produk obat mRNA-LNP. Melalui pemilihan jenis membran, pemotongan berat molekul (MWCO), dan bahan membran yang tepat, TFF memungkinkan penghilangan produk sampingan reaksi dan pengotor dengan berat molekul rendah secara efisien, sekaligus memfasilitasi pertukaran buffer dan konsentrasi sebelum dan sesudah enkapsulasi LNP. Hal ini secara signifikan meningkatkan kemurnian RNA, stabilitas, dan skalabilitas proses secara keseluruhan.
Selain itu, kinerja filtrasi aliran tangensial dipengaruhi oleh faktor konfigurasi sistem seperti jenis pompa dan desain tabung, serta parameter proses utama termasuk tekanan transmembran (TMP), tegangan geser, dan fluks filtrasi. Faktor-faktor ini harus dipilih dan dioptimalkan secara cermat berdasarkan karakteristik produk target, khususnya untuk produk yang sensitif terhadap tekanan seperti mRNA–LNP, yang sangat rentan terhadap kekuatan mekanis eksternal selama pemrosesan.
Pemurnian DNA plasmid
Persiapan larutan stok DNA plasmid pada dasarnya didasarkan pada desain urutan cetakan transkripsi. Metode preparasi biasanya melibatkan amplifikasi DNA plasmid, meskipun amplifikasi PCR juga dapat digunakan. Mengambil amplifikasi DNA sebagai contoh, direkayasaE.colibiasanya digunakan untuk amplifikasi berbasis fermentasi-. Proses pemurnian hilir terutama mencakup pengumpulan sel, lisis dan klarifikasi, pertukaran konsentrasi dan buffer, filtrasi steril, linearisasi, dan pemurnian kromatografi. Dalam lingkungan industri, sentrifugasi aliran kontinu-sering digunakan untuk pengumpulan sel, namun menghasilkan gaya geser yang relatif tinggi. Sistem serat berongga, dengan saluran terbuka dan geser rendah, lebih cocok untuk menangani sampel dengan kandungan padat tinggi, viskositas tinggi, atau sensitivitas geser, seperti DNA plasmid. Setelah pengumpulan, sel-sel tersebut mengalami homogenisasi tekanan tinggi, ultrasonikasi, atau lisis basa, diikuti dengan klarifikasi awal melalui penyaringan kedalaman.
Untuk memfasilitasi kromatografi selanjutnya, filtrasi aliran tangensial (TFF) menggunakan kaset membran atau kolom serat berongga dengan potongan berat molekul 30 kDa, 100 kDa, atau 300 kDa sering kali digunakan terlebih dahulu untuk konsentrasi dan pertukaran buffer. Hal ini mengurangi volume sampel sekaligus menghilangkan beberapa kotoran seperti RNA, protein sel inang (HCP), dan fragmen DNA sel inang (HCD). Kromatografi berfungsi sebagai langkah pemurnian inti. Biasanya, kromatografi penukar anion (AEX) dikombinasikan dengan kromatografi interaksi hidrofobik (HIC) untuk menghilangkan pengotor secara efisien dan memperkaya DNA plasmid superkoil yang sangat bioaktif, sehingga meningkatkan kemurnian plasmid secara signifikan.
Setelah pemurnian, plasmid dikenakan TFF lagi untuk memekatkan larutan ke konsentrasi target (biasanya 0,5–2 mg/mL) dan untuk melakukan dialisis dengan buffer penyimpanan akhir. Langkah ini menghilangkan sisa garam dan pelarut organik dari proses, memastikan bahwa sistem buffer memenuhi persyaratan untuk reaksi transkripsi in vitro (IVT) hilir.
Pemurnian mRNA transkrip in vitro (IVT).
Transkripsi in vitro (IVT) dan modifikasi adalah proses kunci untuk persiapan larutan stok mRNA. Selama produksi IVT mRNA, kombinasi filtrasi aliran tangensial (TFF1) – kromatografi – filtrasi aliran tangensial (TFF2) digunakan. Strategi ini memastikan pemurnian mRNA yang efisien dan berkualitas tinggi, sehingga memberikan dukungan penting untuk pembuatan vaksin.
Setelah reaksi transkripsi dan modifikasi selesai, ultrafiltrasi/diafiltrasi menggunakan kaset membran atau kolom serat berongga dengan potongan berat molekul-30 kDa, 100 kDa, atau 300 kDa biasanya dilakukan terlebih dahulu. Langkah ini secara efektif menghilangkan berbagai kotoran terkait proses dari sistem reaksi, seperti RNA polimerase, sisa fragmen DNA, NTP yang tidak bereaksi, enzim pembatas, RNA untai ganda (dsRNA), dan inhibitor molekul kecil, sekaligus mencapai pertukaran buffer. Setelah satu langkah filtrasi aliran tangensial, sebagian besar pengotor dihilangkan secara efektif, dan satu-satunya pengotor protein sisa yang terdeteksi adalah RNA polimerase.
Selanjutnya, beberapa teknik kromatografi diterapkan untuk pemurnian lebih lanjut. Metode yang umum digunakan meliputi kromatografi afinitas, kromatografi-eksklusi ukuran, kromatografi fase-pasangan ion terbalik, dan kromatografi pertukaran ion. Melalui kombinasi ultrafiltrasi dan kromatografi sekuensial, mRNA mencapai tingkat kemurnian yang tinggi.
Untuk memenuhi persyaratan formulasi atau penyimpanan, larutan stok mRNA dipekatkan lagi atau diencerkan menggunakan kaset membran 30 kDa, 100 kDa, atau 300 kDa atau kolom serat berongga untuk menyesuaikan konsentrasi target secara tepat dan menukarnya ke dalam buffer formulasi akhir. Terakhir, filtrasi tingkat -steril diterapkan untuk mengontrol jumlah mikroba, menyelesaikan penyimpanan sementara dan pengisian bahan.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Pemurnian formulasi mRNA-LNP
Nanopartikel lipid (LNP) saat ini merupakan sistem pengiriman yang paling banyak dipelajari untuk terapi mRNA. Saat ini, berbagai formulasi mRNA-LNP berada dalam tahap pengembangan praklinis dan klinis yang berbeda. LNP sangat sensitif terhadap proses manufaktur. Di antara operasi unit yang diperlukan untuk produksi mRNA-LNP, konsentrasi dan pertukaran buffer melalui filtrasi aliran tangensial (TFF) serta filtrasi steril menghadirkan tantangan yang signifikan. Langkah-langkah ini harus dioptimalkan secara hati-hati untuk memastikan skalabilitas proses dan kualitas produk, sekaligus menghindari masalah seperti pengotoran membran dan pemuatan filter yang salah.
Setelah enkapsulasi mRNA, filtrasi aliran tangensial (TFF) digunakan untuk pemurnian. Tujuan dari langkah ini adalah untuk menghilangkan mRNA yang tidak terenkapsulasi, polimer bebas atau bahan lipid, serta sisa pelarut dari mRNA dan lipid. Karena mRNA-LNP menunjukkan stabilitas yang terbatas pada suhu kamar, optimalisasi proses hilir, termasuk TFF, sangat penting untuk menjaga kualitas produk.
Arah pengoptimalan utama meliputi: menyetel tekanan transmembran (TMP) dan laju aliran tangensial dengan tepat berdasarkan ukuran partikel dan stabilitas mRNA-LNP untuk menyeimbangkan efisiensi filtrasi dan tekanan partikel; memilih membran atau kolom serat berongga dengan batas berat molekul yang sesuai (MWCO, misalnya 100 kDa atau 300 kDa) untuk secara efisien menghilangkan mRNA bebas, pengotor, dan buffer pertukaran sekaligus meminimalkan adsorpsi atau kerusakan partikel; dan mengoptimalkan konsentrasi dan volume diafiltrasi untuk memastikan pertukaran buffer yang efektif ke dalam formulasi target dan mengontrol konsentrasi dan dispersi partikel akhir.
Selain itu, atribut kualitas penting (seperti ukuran partikel, indeks polidispersitas [PDI], dan efisiensi enkapsulasi mRNA) harus dipantau secara ketat selama proses, dan parameter disesuaikan secara dinamis berdasarkan data-waktu nyata untuk mencapai pemurnian dan formulasi mRNA-LNP yang stabil, dapat diskalakan, dan efisien.
Selain itu, karena ketidakstabilan mRNA-LNP dan komponennya dalam metode sterilisasi terminal, filter kelas-steril berukuran 0,2 µm biasanya digunakan untuk menghilangkan bakteri dan kontaminan mikroba lainnya.
