Teknologi Membran dan Klarifikasi Vaksin (Ⅰ)
Vaksin berasal dari berbagai sumber, termasuk ekstrak jaringan, sel bakteri, partikel virus, protein, dan asam nukleat yang diproduksi oleh sel rekombinan mamalia, sel ragi, dan sel serangga.
Metode produksi vaksin yang paling umum didasarkan pada proses fermentasi awal yang diikuti oleh pemurnian. Produksi vaksin adalah proses kompleks yang melibatkan banyak langkah dan proses yang berbeda. Memilih metode pemurnian yang tepat sangat penting untuk mencapai kemurnian produk akhir yang diinginkan. Klarifikasi vaksin merupakan langkah penting yang memiliki dampak signifikan pada pemulihan produk dan pemurnian hilir berikutnya. Beberapa teknik dapat digunakan untuk mengklarifikasi vaksin. Pilihan metode dan peralatan pengumpulan bergantung pada jenis baterai, sifat produk yang dikumpulkan, dan cairan proses. Teknik-teknik ini meliputi filtrasi membran (mikrofiltrasi, filtrasi aliran tangensial), sentrifugasi, dan filtrasi dalam (filtrasi aliran normal). Dari pengalaman yang panjang, klarifikasi panen vaksin biasanya dicapai dengan sentrifugasi diikuti oleh filtrasi dalam.
Dalam beberapa tahun terakhir, teknik berbasis membran telah menjadi terkenal dalam klarifikasi vaksin. Proses hulu semakin banyak menggunakan teknologi sekali pakai, sehingga strategi pemanenan harus diubah. Artikel ini memberikan gambaran menyeluruh tentang berbagai teknologi berbasis membran dan aplikasinya dalam klarifikasi vaksin.
01 Pendahuluan
Vaksin merupakan komponen penting dalam pencegahan penyakit menular, yang masih menjadi penyebab kematian yang mengejutkan. Setiap tahun, sekitar 2 hingga 3 juta orang terselamatkan dari penyakit difteri, tetanus, batuk rejan, dan campak berkat imunisasi. Vaksin mencakup berbagai macam hal, mulai dari protein rekombinan kecil hingga partikel virus utuh dan bakteri utuh. Vaksin dapat diproduksi oleh berbagai sistem: telur, sel mamalia, bakteri, dll. Karena kompleksitas dan keragaman vaksin, saat ini belum ada protokol atau templat pemurnian yang umum, meskipun minat terhadap platform vaksin terus meningkat.
Biasanya, proses vaksin dapat dibagi menjadi tiga bagian: hulu (produksi dan klarifikasi), pengolahan hilir (pemurnian termasuk ultrafiltrasi, kromatografi, dan pengolahan kimia), dan formulasi (operasi pengisian akhir). Terlepas dari sistem produksi, klarifikasi (penghapusan awal zat yang tidak diinginkan) memainkan peran penting dalam menentukan proses pemurnian yang kuat. Langkah klarifikasi yang tepat terutama menghilangkan sel utuh, serpihan sel, koloid, dan agregat besar untuk mengurangi beban pengolahan hilir. Dalam beberapa kasus, klarifikasi juga dapat mengurangi pengotor yang tidak larut, protein sel inang (HCP), dan asam nukleat sel inang. Seperti langkah pemurnian lainnya, langkah klarifikasi perlu dioptimalkan untuk mencapai hasil dan kemurnian produk maksimum sambil beradaptasi dengan spesifisitas dan kendala produksi vaksin.
Karena heterogenitas jenis vaksin, berbagai teknik digunakan untuk klarifikasi, termasuk sentrifugasi atau filtrasi (Tabel 1).
Beberapa rangkaian operasi biasanya diperlukan untuk mencapai klarifikasi yang diinginkan. Operasi pertama dirancang untuk menghilangkan partikel yang lebih besar (klarifikasi primer) dan operasi kedua dirancang untuk menghilangkan koloid dan partikel sub-mikron lainnya (klarifikasi sekunder). Sentrifugasi kecepatan rendah berfungsi sebagai opsi klarifikasi satu kali, yang memungkinkan sel dan serpihan sel dihilangkan dengan presipitasi. Sentrifugasi dapat menangani beban padat yang tinggi dan telah banyak digunakan dalam mode batch atau kontinyu dan sentrifus cakram. Ini membutuhkan investasi modal dan biaya perawatan yang tinggi, dan menghadapi tantangan dalam peningkatan skala karena kurangnya model skala-turun yang andal. Namun, beberapa produsen vaksin komersial menggunakan sentrifus dalam produksi skala besar yang melibatkan volume pemrosesan tinggi dan lebih banyak aktivitas produksi.
Filtrasi klarifikasi dapat dilakukan dengan filtrasi aliran normal (NFF, juga dikenal sebagai filtrasi buntu) atau filtrasi aliran tangensial (TFF, juga dikenal sebagai filtrasi aliran silang). Ada juga mode filter khusus (filter dalam) yang mengandung bahan bermuatan positif dan filter AIDS yang meningkatkan retensi serpihan sel, koloid, dan komponen yang tidak diinginkan bermuatan negatif.
Filter membran menahan partikel dengan pengecualian ukuran dan tidak memiliki kapasitas retensi kotoran yang tinggi, sehingga cocok untuk langkah klarifikasi sekunder. Baik filter dalam maupun filter membran mudah diskalakan dan diterapkan (desain sistem sederhana). Tidak seperti NFF, TFF terutama digunakan untuk klarifikasi primer (mikrofiltrasi). Membran dengan rentang batas 0.1-0.65 μm (sebaiknya dengan saluran terbuka) telah berhasil digunakan untuk menahan sel, serpihan sel, dan kontaminan besar lainnya. Sebagian besar peralatan TFF dapat diskalakan secara linier dan dapat digunakan kembali setelah dibersihkan, yang secara signifikan mengurangi biaya bahan habis pakai untuk langkah tersebut.
Langkah klarifikasi terletak di antara proses hulu dan hilir dan terkadang diabaikan selama pengembangan proses vaksin karena waktu dan sumber daya diprioritaskan untuk langkah pemurnian lainnya, seperti kromatografi atau sentrifugasi gradien densitas.
Bahkan paten untuk proses pembuatan vaksin sering kali mengabaikan langkah klarifikasi. Efisiensi klarifikasi secara langsung memengaruhi kinerja proses hilir. Langkah klarifikasi yang tidak dioptimalkan dengan baik dapat memengaruhi kapasitas filter yang disterilkan secara negatif atau dapat memperpendek masa pakai resin kromatografi. Saat ini, ekspektasi regulasi yang lebih ketat cenderung membuat produsen vaksin memproduksi vaksin yang lebih murni, berkarakteristik baik, tetapi terjangkau. Dalam hal ini, setiap langkah perlu diberi perhatian yang layak. Tren saat ini menunjukkan bahwa proses hulu bergerak menuju sistem ekspresi yang "lebih bersih" (yaitu sel yang dikultur dalam media bebas serum menggantikan telur) dengan peningkatan produktivitas dan kepadatan sel yang lebih tinggi.
Proses pemurnian hilir disederhanakan dan dirampingkan untuk meningkatkan kemurnian produk akhir. Untuk menangani perubahan ini, langkah klarifikasi tidak boleh menjadi hambatan. Dalam hal ini, teknologi penyaringan menghadapi tantangan klarifikasi baru, mengatasi masalah peningkatan fleksibilitas proses, kemungkinan penggunaan tunggal, dan pengurangan biaya investasi.
02 Klarifikasi vaksin virus
Beberapa jenis metode klarifikasi, baik sendiri maupun kombinasi, telah berhasil digunakan untuk mengklarifikasi panen di ujung umpan vaksin.
Skala pilot: 1-20L, skala produksi: lebih dari 20L
2.1 Tindakan pencegahan untuk klarifikasi vaksin virus
Banyak vaksin yang mengandung sebagian atau seluruh partikel virus untuk membentuk kekebalan terhadap infeksi virus. Vaksin umumnya terbagi dalam empat kategori besar:
Vaksin hidup yang dilemahkan (LAV), yang dibuat dari strain virus yang dilemahkan untuk mengurangi virulensinya. Virus yang dilemahkan dapat bereplikasi di dalam tubuh tetapi tidak bersifat patogen.
- Vaksin virus yang dinonaktifkan (IV), yang mengandung virus yang dinonaktifkan secara kimiawi atau ultraviolet untuk menghilangkan daya infeksi. Partikel virus dapat berupa lengkap, terbagi, atau dimurnikan (hanya protein antigenik).
- Vaksin vektor virus (VV) adalah virus aktif non-patogen yang menghadirkan antigen virus patogen. Struktur yang baru dikembangkan ini juga digunakan untuk aplikasi terapi gen.
Vaksin partikel mirip virus (VLP), kelas spesifik vaksin subunit virus yang meniru keseluruhan struktur partikel virus tetapi tidak mengandung materi genetik yang menular.
Dalam kebanyakan kasus, partikel virus sepenuhnya utuh selama langkah klarifikasi, bahkan selama lisis vaksin virus (pembelahan biasanya dilakukan di hilir, dalam lingkungan yang lebih murni).
Tantangan utama klarifikasi virus adalah pemulihan partikel virus hasil tinggi sambil secara efisien membuang serpihan sel, agregat besar, dan kontaminan yang tidak larut. Seperti yang dijelaskan dalam bagian berikut, ada beberapa faktor yang dapat menyebabkan degradasi atau hilangnya virus. Selain itu, hasil virus sulit diandalkan karena variabilitas tinggi metode uji kuantitatif virus pada tahap proses ini, terutama untuk vaksin LAV dan VV. Untuk vaksin ini, hasil virus sering dievaluasi menggunakan uji infeksi seperti uji plak atau uji TCID 50. Fakta bahwa beberapa senyawa yang dipanen dapat mengganggu kemampuan virus untuk menginfeksi sel yang mengindikasikan meningkatkan variabilitas pendekatan kuantitatif ini.
2.2 Strategi klarifikasi vaksin virus
Vaksin virus sangat bervariasi dalam ukuran, struktur, bentuk, dan sistem ekspresi (Tabel 3).
Akibatnya, secara umum tidak ada pola dasar untuk proses hilirnya, terutama langkah-langkah klarifikasi. Secara teori, semua teknik yang tersedia (sentrifugasi kecepatan rendah, mikrofiltrasi TFF, NFF) dapat dipilih dan berpotensi dikombinasikan untuk mengklarifikasi virus. Faktanya, keberhasilan metode klarifikasi dipengaruhi oleh sistem ekspresi dan sifat fisikokimia virus yang terlibat.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} sel/ml) metode klarifikasi, menggunakan polimer kationik, mengurangi area filtrasi dalam sebanyak 4 kali lipat dibandingkan dengan metode tradisional. Teknik ini memungkinkan pemanenan fermenter berkapasitas besar tanpa menggunakan sentrifus. Demikian pula, Riske dkk. menunjukkan bahwa perlakuan kitosan pada kultur sel 40 L (0,02%) yang mengandung padatan 1,6% menyebabkan peningkatan 7-kali lipat dalam kapasitas filter absolut setelah filtrasi dalam.
Mereka juga menyebutkan bahwa kitosan tampaknya meningkatkan efisiensi klarifikasi dengan menggumpalkan partikel submikron, yang biasanya mengendap dalam sentrifus. Metode praperlakuan dan flokulasi kemungkinan akan terus menjadi bagian dari klarifikasi filtrasi vaksin di masa mendatang. Penetran, termasuk gula, glikol, dan asam amino, lebih disukai menggumpalkan virus. Flokulasi virus dengan larutan osmotik diikuti oleh mikrofiltrasi 0.2µ dapat digunakan sebagai proses komprehensif untuk pemurnian virus. Penetran dapat merangsang agregasi virus dengan mengurangi lapisan hidrasi di sekitar partikel untuk menggumpalkan partikel virus hidrofobik yang tidak berkapsul dan partikel virus yang berkapsul. Meskipun penetran telah terbukti menggumpalkan virus, metode ini berpotensi menjadi platform untuk pemurnian vaksin di masa mendatang, dan kelayakannya dalam pemurnian vaksin percontohan atau skala besar belum terbukti. Metode praperlakuan flokulasi, yang kemungkinan akan terus menjadi bagian dari klarifikasi filter vaksin di masa mendatang, dilakukan dalam fermentor 2L. Agar berpotensi digunakan dalam operasi produksi berskala besar, metode ini perlu divalidasi pada skala percontohan dan produksi.
2.2.1 Mengekspresikan dampak sistem
Metode klarifikasi terutama bergantung pada jenis proses hulu dan sistem ekspresi, yang menentukan jenis dan tingkat kontaminan yang akan dihilangkan. Vaksin virus biasanya diproduksi dalam embrio ayam oleh garis sel mamalia atau burung yang berkesinambungan atau sel baculovirus/serangga, yang merupakan sistem ekspresi yang lebih kompleks. Beberapa jenis VLP juga dapat diproduksi oleh sistem ekspresi heterolog lainnya (bakteri, ragi, sel tanaman).
2.2.1.1 Virus yang dihasilkan dalam embrio ayam
Vaksin telah diproduksi dalam telur selama beberapa dekade. Pekerjaan ini dimulai pada tahun 1931, ketika Woodruff dan Good Pasture berhasil menggunakan membran chorio-allantoic dari telur yang subur sebagai substrat untuk pertumbuhan virus. Saat ini, banyak vaksin manusia dan hewan masih diproduksi menggunakan proses kuno ini. Yang paling terkenal mungkin adalah vaksin flu musiman. Prinsipnya adalah menginokulasi telur ayam dengan virus yang diinginkan dan kemudian bereplikasi dalam membran chorio-allantoic. Setelah reproduksi, cairan allantoic yang kaya akan partikel virus dikumpulkan dan dimurnikan.
Cairan alantois merupakan pakan penjernih yang menantang. Kandungan mineral dan proteinnya yang tinggi (termasuk ovalbumin) membuatnya memiliki viskositas yang tinggi. Cairan alantois juga mengandung senyawa jaringan esensial dari embrio ayam, seperti bulu, paruh, pembuluh darah, atau sel darah. Karena kandungan padatan yang tinggi, sentrifugasi kecepatan rendah merupakan pilihan yang lebih disukai untuk penjernihan primer, yang biasanya menghasilkan tingkat pemulihan sekitar 70%. Namun, penjernihan primer menggunakan teknik penyaringan juga memungkinkan. Untuk NFF, filter dalam berbasis polipropilena dan selulosa memiliki kemampuan pengumpulan cairan alantois yang baik. Filter permukaan yang terbuat dari filter dalam berbasis polipropilena atau selulosa dapat memiliki kapasitas 150-210 L/m² dan mengurangi kekeruhan aliran umpan hingga 3 kali lipat. Perangkat TFF saluran umpan terbuka juga cocok untuk penjernihan cairan alantois, karena perangkat ini lebih cocok untuk kehilangan tekanan minimum melalui saluran umpan, sehingga mengurangi penyumbatan saluran.
Langkah klarifikasi sekunder dapat dilakukan dengan mudah menggunakan NFF. Kombinasi bahan polipropilena, selulosa, dan serat kaca umumnya menunjukkan efisiensi yang baik, dan alternatif untuk langkah klarifikasi sekunder adalah menggunakan TFF dan perangkat membran mikrofiltrasi 0,65μm atau 0,45μm serta mengoperasikan kontrol fluks osmotik. Perangkat TFF saluran terbuka dengan PVDF hidrofilik atau membran PES hidrofilik dapat digunakan dalam langkah ini.
Penting untuk dicatat bahwa partikel virus dapat dikaitkan dengan material serpihan yang tidak larut, yang dapat secara signifikan mengurangi produksi virus selama proses klarifikasi. Penggunaan larutan garam dapat mengurangi hubungan antara virus influenza dan fragmen padat, sehingga menghasilkan peningkatan produksi sekitar dua kali lipat tanpa memengaruhi integritas partikel virus.
2.2.1.2 Virus yang diproduksi dalam garis sel mamalia dan burung yang berurutan
Baru-baru ini, beberapa vaksin virus telah beralih dari proses berbasis telur ke proses berbasis kultur sel (terutama untuk vaksin influenza). Alasan utama peralihan ini adalah untuk mencegah masalah produksi vaksin yang terkait dengan telur embrionik (yaitu kekurangan pasokan telur yang dapat terjadi jika terjadi wabah penyakit unggas). Akibatnya, banyak jenis vaksin dan vektor virus saat ini dikembangkan menggunakan galur sel berkelanjutan dari mamalia atau burung, galur sel konvensional (seperti galur sel Vero, MDCK, atau HEK293), atau galur sel milik perusahaan.
Bergantung pada sistem ekspresi, virus dapat tetap berada di dalam sel, sehingga memerlukan langkah lisis sel, atau dapat tetap berada di luar sel (lisis atau pembentukan tunas). Muatan padat dan kandungan terlarut yang diperoleh dari kultur sel jauh lebih bersih daripada fase cair alantois. Hasilnya, teknologi NFF lebih mudah diterapkan dan kapasitasnya jauh lebih tinggi. Namun, kapasitas filtrasi sangat bergantung pada kondisi kultur sel, seperti kepadatan sel atau viabilitas sel saat panen. Parameter ini memengaruhi jumlah serpihan sel dan makroagregat yang dapat menyumbat filter dan membran dalam, sehingga mengakibatkan berkurangnya kapasitas.
Thomassen et al memberikan contoh klarifikasi NFF yang baik. Digunakan dalam proses produksi virus polio yang dinonaktifkan (IPV). Sel Vero yang dikultur pada mikropembawa digunakan untuk proliferasi virus dengan kepadatan sel sebesar {{0}}.78 x 106 sel/ml TOI. Saringan baja tahan karat 75μm digunakan untuk pra-klarifikasi guna menghilangkan mikropembawa dari hasil panen. Pemeringkatan lapisan ganda diklarifikasi menggunakan filter kepadatan dalam (0.2-2.0μm), diikuti oleh filter pemeringkatan yang disterilkan.
Unit sekali pakai yang dapat diskalakan yang dipilih berhasil digunakan untuk persiapan bahan uji klinis Sabin IPV pada skala 350 L. Bergantung pada serotipe virus, diperoleh tingkat pemulihan virus sebesar 86 hingga 96 persen.
2.2.1.3 Baculovirus/partikel mirip virus yang diproduksi dalam sistem sel serangga
Pertimbangan sistem sel baculovirus/serangga untuk produksi vaksin skala besar relatif baru, tetapi menarik minat yang semakin meningkat di bidang vektor virus dan VLP. Manfaat utama sistem ini adalah melibatkan produksi jangka pendek (tidak perlu membuat garis sel) dan aman (tidak ada DNA virus lengkap). Ada juga beberapa kelemahan, seperti perlunya penghilangan baculovirus dan stabilitas produk.
Cervarix, vaksin VLP terhadap infeksi human papillomavirus yang diproduksi oleh GlaxoSmithKline, adalah vaksin manusia pertama yang diproduksi secara komersial dalam sel serangga. Sejumlah vaksin berdasarkan VLP dan vektor rAAV yang diproduksi dalam sel serangga yang terinfeksi baculovirus saat ini sedang dalam pengembangan. Lini sel serangga yang berasal dari ulat grayak musim gugur Spodoptera frugiperda (Sf9 dan Sf21) dan ulat kubis Trichoplusia ni (sel BTI-TN5B1-4) adalah yang paling umum digunakan karena kemampuannya untuk tumbuh dalam suspensi, yang menyederhanakan amplifikasi proses hulu. Setelah tumbuh hingga kepadatan sel hidup yang diinginkan, sel-sel ini terinfeksi dengan baculovirus rekombinan dalam fase pertumbuhan sel eksponensial untuk ekspresi protein. Genom baculovirus yang besar memungkinkan ekspresi lima atau lebih protein yang berbeda, yang sesuai dengan kompleksitas VLP dan vektor virus.
Bernard dkk. menjelaskan proses hilir kultur sel serangga. Prosesnya sangat bervariasi, mencerminkan keragaman protein yang dihasilkan dengan teknik ini. Langkah pertama dari rangkaian pemurnian sangat dipengaruhi oleh karakteristik volume bioreaktor (yaitu, kepadatan dan viabilitas sel), atau oleh sifat pelepasan produk (disekresikan oleh tunas atau lisis sel). Infeksi Baculovirus pada sel serangga dapat menyebabkan lisis sel dalam waktu 3-5 hari. Penghancuran sel dapat menyebabkan peningkatan aktivitas proteolitik dan faktor lingkungan lainnya yang dapat menyebabkan degradasi protein rekombinan.
Telah ada upaya untuk mengembangkan baculovirus dengan kemampuan yang lebih rendah untuk memulai lisis sel. Baculovirus melisiskan kurang dari 10 persen serangga yang terinfeksi.
Lisis sel dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode, seperti pembekuan-pencairan, deterjen, homogenizer, atau perawatan ultrasonik. Sel serangga tidak memiliki dinding sel dan karena itu larut dengan cepat. Meskipun perawatan ultrasonik telah dilaporkan dalam banyak proses laboratorium, perawatan ini jarang digunakan dalam skala eksperimen atau komersial. Metode yang paling umum adalah menggunakan homogenizer untuk menghancurkan sel dengan adanya deterjen konsentrasi rendah (0.1% Triton X-100 atau NP-40). Penggunaan deterjen dan mikrofluidisasi atau homogenisasi impak osmotik telah berhasil digunakan dalam banyak proses manufaktur skala besar. Biasanya, sel serangga disuspensikan dalam buffer lisis (50 mM TRIS pH7,7, 300 mM NaCl, 5% gliserol, 0,2 mM PMSF, dan inhibitor protease), di mana Triton-X100 ditambahkan ke konsentrasi akhir 0,1%, diikuti oleh ultrasonik ringan atau mikrofluidisasi. Campuran tersebut kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan partikel yang tidak larut.
Pada tahap ini, lisat mungkin tampak sangat keruh dan sulit disaring menggunakan filter 0.45μm. Terkadang kehilangan hingga 30% dapat diamati selama langkah klarifikasi pirolisis. Penambahan benzoenzim pada tahap pembelahan membantu memecahkan masalah penyaringan. Membersihkan sel dengan air garam penyangga fosfat setelah panen dan "pembekuan-pencairan" cepat dalam garam tinggi (500mM NaCl) yang mengandung penyangga retak membantu menghilangkan agregat.
Klarifikasi VLP dan vektor virus yang diproduksi oleh sel serangga terjadi setelah lisis sel (dengan pengobatan kimia atau mekanis), yang melepaskan tidak hanya partikel virus tetapi juga sejumlah besar asam nukleat seluler. Sel serangga mampu tumbuh pada kepadatan sel yang tinggi, dari 1-9.10 6 sel/ml. Oleh karena itu, langkah klarifikasi harus menangani kepadatan sel yang tinggi, kandungan asam nukleat yang tinggi dan, jika memungkinkan, pembuangan partikel baculovirus. Untuk membuat masalah menjadi lebih rumit, VLP atau vektor virus dan baculovirus dapat memiliki ukuran yang sama (baculovirus lebarnya 60-80 nanometer dan panjangnya 300-400 nanometer). Karena kepadatan sel yang tinggi, sentrifugasi telah menjadi teknik yang disukai untuk klarifikasi primer selama beberapa dekade. Namun, proses membran tampaknya menjadi alternatif yang sangat menarik karena skalabilitas mudah didefinisikan.
Filter dalam telah digunakan secara efektif dalam proses hilir partikel mirip rotavirus tiga lapis. Di tingkat laboratorium, metode ultracentrifugasi gradien densitas CsCl sering digunakan untuk memurnikan partikel kompleks ini. Para peneliti mengevaluasi tidak hanya langkah klarifikasi filter dalam, tetapi juga seluruh proses hilir (pembelahan Triton X-100 dan filtrasi dalam, diikuti oleh ultrafiltrasi dan pengecualian ukuran partikel). Hasilnya menunjukkan bahwa hasil gradien densitas CsCl dapat mencapai 37%.
Metode ultra-sentrifugal sekitar 10%. Sebagai contoh lain, serat berongga 0,45μm dan serat berdiameter halus 500 kDa digunakan untuk memulihkan dan memusatkan partikel mirip HIV yang diproduksi dalam sel serangga. Dalam penelitian ini, gaya geser serat berongga dioptimalkan berdasarkan integritas sel. Hasil Proses gaya geser rendah ditetapkan untuk menggantikan ultracentrifugasi gradien gula meja.
Proses ini berpotensi untuk diterapkan pada produksi massal. Filter dalam juga telah berhasil digunakan dalam produksi virus adeno-associated rekombinan. Lisis sel dilakukan dengan pengacau sel mekanis dua piston, diikuti oleh perawatan nuklease. Pada langkah klarifikasi, elemen filter dalam serat kaca 1,2μm digunakan, diikuti oleh dua lapisan PES hidrofilik 0.8μm dan PES hidrofilik 0.2μm. Filter berukuran proporsional digunakan untuk batch proses dari yang lebih kecil hingga ukuran 200 L. Filter dalam telah berhasil digunakan, dan peringkat TFF dengan film datar atau serat berongga 0,2µm atau 0,45µm juga telah dilaporkan sangat efektif.
Penelitian oleh Tecnologica (IBET) di Institut Biologi Eksperimental Oeiras di Portugal menggunakan NFF untuk melakukan klarifikasi VLP hepatitis C yang diekspresikan oleh baculovirus tanpa sentrifugasi. Filter polipropilena dengan peringkat nominal (10,5,0.6 dan 0.3μm) digunakan untuk mengklarifikasi pemanenan VLP. Filter yang sama dengan peringkat pori 0.6μm dan 0.3μm digunakan untuk penyaringan di pusat pemanenan VLP. Semua filtrat yang diteliti diuji untuk tingkat pemulihan HCV-VLP dan metode penyaringan yang direkomendasikan dibandingkan. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 4.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa filter 5μm-0.3μm memiliki perolehan produk tertinggi (100%) untuk pakan VLP hepatitis C yang dipanen secara langsung. Filter polipropilena 0,6μm memiliki perolehan produk tertinggi (82%) untuk pakan sentral, dan pembersihan DNA sel inang sekitar 70%.
2.2.1.4 Partikel mirip virus yang diproduksi dalam sistem bakteri atau ragi
Jenis metode klarifikasi untuk vaksin VLP yang diekspresikan dalam sistem bakteri atau khamir bergantung pada pelepasan VLP ke mediator ekstraseluler. Jika VLP tidak dapat disekresikan secara efisien, lisis sel atau langkah ekstraksi lainnya mungkin diperlukan sebelum langkah klarifikasi yang sebenarnya. Meskipun ini merupakan standar emas dalam industri klarifikasi protein, sentrifugasi (kontinu atau batch) yang diekspresikan dalam sistem berbasis bakteri atau khamir, baru-baru ini, proses membran telah menjadi alternatif yang sangat menarik karena kemudahan skalabilitas dan kompatibilitasnya dengan perawatan sekali pakai.
Richter dan Topell menjelaskan penggunaan sentrifugasi, TFF, atau kombinasi keduanya saat menyiapkan VLP yang diproduksi dalam E. coli yang dijernihkan. Dalam penelitian mereka, membran TFF 0.45m digunakan untuk mengencerkan dan menjernihkan homogenat E. coli yang dihomogenkan pada suhu 5 derajat. Mereka juga mencatat bahwa TFF berbasis membran cocok untuk menangani panen viskositas tinggi, sebaiknya menggunakan unit TFF dengan konfigurasi saluran terbuka.
Klarifikasi sentrifugal juga telah dievaluasi sebagai alternatif TFF. Dalam kasus ini, homogenat yang dihasilkan tidak diencerkan dan disentrifugasi pada suhu 4 derajat selama 105 menit, 10000g. Tanpa memindahkan lapisan lunak, supernatan dituang keluar dari partikel dan disentrifugasi ulang pada suhu 4 derajat dan 10.000 g selama 60 menit. Supernatan kemudian dikeluarkan dari partikel saat ini, diencerkan dengan buffer EB (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2, dan disaring pada perangkat penyaring steril 0,22 m. Pemrosesan lebih lanjut. Proses peningkatan skala untuk produksi vaksin VLP ini dalam E. coli pada skala 800L juga dilaporkan dijernihkan dengan kombinasi sentrifugasi dan TFF.
Vaksin hepatitis E rekombinan HEV 239 telah dilisensikan di Tiongkok untuk mengimunisasi orang dewasa berusia 16 tahun ke atas. Antigen vaksin (VLP) diekspresikan dalam E. coli, dan peningkatan skala proses produksi antigen telah ditunjukkan pada skala 50L. Produk diekstraksi dengan memecahkan E. coli dan badan inklusi dipisahkan dari fragmen sel dengan pencucian berat menggunakan buffer yang mengandung 2% Triton X-100 dan kemudian dilarutkan dengan homogenizer urea 4 M. TFF mengklarifikasi VLP human papillomavirus yang diproduksi dalam Saccharomyces cerevisiae (15L). Lisat sel yang diolah dengan nuklease diklarifikasi dengan mikrofiltrasi aliran silang dalam mode transfiltrasi menggunakan filter serat berongga 0,65 μm. Proses yang sama digunakan dalam produksi vaksin. Meskipun hanya segelintir vaksin berbasis VLP yang telah mencapai skala komersial, beberapa vaksin berbasis VLP sedang dalam pengembangan, yang sebagian besar diklarifikasi menggunakan sentrifugasi atau teknologi membran.
Karena keterbatasan ruang, kami akan membagikan bagian kedua dari konten ini di bab berikutnya. Di artikel berikutnya, kami akan membagikan beberapa kasus klarifikasi vaksin dan penggunaan komponen membran yang relevan.
Sebagai perusahaan pertama dalam sirkuit lokalisasi, Guidling Technology telah mengumpulkan cukup banyak pengalaman relevan dalam klarifikasi vaksin. Guidling Technology adalah perusahaan pengembangan dan produksi yang berfokus pada biofarmasi dan kultur sel, pemurnian dan pemisahan. Produk digunakan secara luas dalam biomedis, diagnosis, filtrasi cairan industri, deteksi, klarifikasi, pemurnian dan proses konsentrasi; Guidling telah berhasil mengembangkan tabung sentrifus ultrafiltrasi, kaset membran ultrafiltrasi/mikrofiltrasi, filter penghilang virus, perangkat filter aliran tangensial, tumpukan membran dalam, dll., yang sepenuhnya memenuhi skenario aplikasi biofarmasi dan kultur sel.
Membran dan filter membran kami digunakan secara luas dalam konsentrasi, ekstraksi, dan pemisahan pra-filtrasi, mikrofiltrasi, ultrafiltrasi, dan nanofiltrasi. Berbagai macam lini produk kami, mulai dari filtrasi laboratorium sekali pakai kecil hingga sistem filtrasi tipe produksi, pengujian sterilitas, fermentasi, kultur sel, dan banyak lagi, dapat memenuhi kebutuhan pengujian dan produksi.
