Panduan untuk Pemurnian Protein Rekombinan Berkualitas Tinggi: Optimalisasi Proses Hilir dan Aplikasi Filtrasi Aliran Tangensial

Recombinant proteins are widely used in biopharmaceuticals, vaccine development, and in vitro diagnostics. Their purification quality directly impacts the activity, stability, and safety of the final product. Downstream purification is the critical step for obtaining high-purity, high-yield proteins. Tangential Flow Filtration (TFF) , due to its efficiency and scalability, semakin menjadi alat vital dalam alur kerja pemurnian protein .

Artikel ini secara sistematis menguraikan langkah -langkah kunci dalam pemurnian hilir protein rekombinan, dengan fokus pada strategi aplikasi teknologi TFF . bertujuan untuk membantu pengguna penelitian dan industri dalam mengoptimalkan proses pemurnian dan meningkatkan kualitas protein .

 

I . Langkah -langkah inti dalam pemurnian protein rekombinan hilir

1. sel panen dan lisis

Sentrifugasi/Filtrasi Kedalaman: Menghapus puing dan kotoran sel; Cocok untuk bakteri, ragi, dll ., sistem ekspresi .

Homogenisasi sonication/tekanan tinggi: merusak sel untuk melepaskan protein target; Kondisi membutuhkan optimasi untuk mencegah denaturasi protein .

Lisis enzimatik: e . g ., pengobatan lisozim untuk bakteri; Kondisi lembut tetapi biaya yang lebih tinggi .

2. Pemurnian Primer: Tangkapan Protein Target

Afinitas kromatografi (e . g ., his-tag, protein A/G): pengikatan spesifisitas tinggi; mencapai kemurnian tinggi dalam satu langkah .

Ion Exchange Chromatography (IEX): memisahkan protein berdasarkan perbedaan muatan; Cocok untuk pemurnian tahap awal-ke-menengah .

Kromatografi Interaksi Hidrofobik (HIC): Memanfaatkan perbedaan hidrofobisitas permukaan protein; efektif untuk protein yang sulit dimurnikan tertentu .

3. Polishing: Peningkatan Kemurnian

Kromatografi Eksklusi-(SEC): Menghapus agregat dan pengotor molekul kecil; Kapasitas pemuatan terbatas .

Kromatografi multimodal (e . g ., capto adhere): menggabungkan beberapa mode interaksi untuk resolusi yang lebih tinggi .

4. konsentrasi dan pertukaran buffer

Perangkat sentrifugal ultrafiltrasi: Cocok untuk sampel skala kecil; rentan terhadap kehilangan protein .

Filtrasi Aliran Tangensial (TFF): Efisien, dapat diskalakan, ideal untuk produksi industri (dirinci nanti) .

5. sterilisasi dan penyimpanan

0 . 22 µm Filtrasi: Menghapus mikroorganisme memastikan sterilitas.

Penambahan stabilisator (e . g ., gliserol, bsa): mencegah degradasi protein .

 

II . Aplikasi kunci dari filtrasi aliran tangensial (TFF) dalam pemurnian hilir

Filtrasi Aliran Tangensial (TFF) mengurangi fouling membran melalui aliran tangensial, membuatnya cocok untuk berkonsentrasi, desalting, dan buffer menukar sampel volume besar . ia menawarkan keunggulan yang signifikan dibandingkan {{{3} {{{3} {{{{3 {{{{3 {{4 {4 {4} {{{{E {3 {{4 {4 {4 {4 {4} {{{{3 {3 {4 {4 {4 {4 {4 {4 {4 {4 {4 {4 {4 {4} {

 

1. Keuntungan dari teknologi TFF

✔ Pemulihan Tinggi: Meminimalkan Kehilangan Adsorpsi Protein, terutama penting untuk sampel berharga .

✔ Skalabilitas linier: berlaku dari skala lab (10 ml) hingga skala produksi (1000l+) .

✔ Fleksibilitas proses: Sistem tunggal dapat melakukan konsentrasi, dialisis (pertukaran buffer), dan diafiltrasi .

 

2. TFF Kaset/Panduan Pilihan Membran

Bahan membran	Karakteristik	Skenario Aplikasi
Polyethersulfone (PES)	Pengikatan protein rendah, stabil secara kimia (tahan pH), fluks tinggi	Kondisi penyangga yang keras
Selulosa Regenerasi (RC)	Pengikatan protein rendah, fluks tinggi, protein rutin	Pemurnian protein/antibodi rutin

Pedoman Seleksi Cut-Off Weight Molecular (MWCO):

1/3 hingga 1/5 dari berat molekul protein target (E . g ., gunakan membran 10 kDa untuk protein 30 kDa) .

Untuk menghapus agregat, pilih ukuran pori yang lebih kecil (e . g ., gunakan membran 50 kDa untuk protein 100 kDa) .

 

3. Optimalisasi parameter operasi TFF kritis

Tekanan transmembran (TMP): biasanya 3–15 psi; TMP yang terlalu tinggi mempromosikan fouling .

Laju aliran tangensial: mempertahankan turbulensi untuk meminimalkan polarisasi konsentrasi; Biasanya 4–8 l/min · m² .

Teknik peningkatan hasil:

Gunakan 2–5 volume buffer selama diafiltrasi untuk pertukaran lengkap .

Lakukan back-flushing di akhir untuk memulihkan protein residu .

 

4. Studi Kasus Khas: Monoclonal Antibody (MAB) Pemurnian

Cairan kultur sel yang diklarifikasi → Kromatografi afinitas protein A → inaktivasi virus rendah pH → konsentrasi TFF + pertukaran buffer → pemolesan (detik/iex) → filtrasi steril

 

Peran TFF:

Dengan cepat memusatkan protein encer A eluat ke konsentrasi target .

Menukar buffer ke PBS atau buffer formulasi (e . g ., buffer histidine) .

 

Iii . Masalah dan solusi umum

❌ Masalah 1: Pemulihan protein rendah

Kemungkinan penyebab: adsorpsi membran; curah hujan karena konsentrasi berlebih .

Solusi: Beralih ke membran pengikat rendah; Tambahkan surfactant (e . g ., 0 . 01% tween 20).

❌ Masalah 2: Penurunan fluks cepat

Kemungkinan penyebab: Polarisasi pembuatan membran atau konsentrasi .

Solusi: Mengoptimalkan laju aliran tangensial; menerapkan back-flushing reguler; Beralih ke struktur membran yang lebih terbuka (e . g ., 30 kDa bukannya 10 kDa) .

❌ Masalah 3: Agregasi Protein

Kemungkinan penyebab: gaya geser yang berlebihan; buffer yang tidak sesuai .

Solusi: Kurangi kecepatan pompa; Gunakan buffer yang lebih lembut (e . g ., mengandung sukrosa atau naCl) .

 

IV . ringkasan

Mendapatkan protein rekombinan berkualitas tinggi bergantung pada pengoptimalan proses pemurnian hilir . Tangensial Flow Filtration (TFF) Teknologi, dengan efisiensi dan skalabilitasnya, telah menjadi alat penting untuk konsentrasi dan pengoptimalan purike,. dengan caning-techying, caning, dan mengoptimalkan puromi, dan mengoptimalkan puromi, dan mengoptimalkan puromy, caning, dan mengoptimalkan cassette membran, dan mengoptimalkan purkasi, caning, dan mengoptimalkan cassette membran pure, {{2} dengan rasional, canpy {{2} dengan rasional, canpy {{2} dengan rasional, canpy {{2} dengan rasional, can. secara signifikan ditingkatkan, memenuhi permintaan penelitian dan produksi skala industri .