Bagikan Sastra|Ucapkan selamat tinggal pada pemurnian yang kompleks? Metode surfaktan TFF + baru meningkatkan efisiensi dan mengurangi biaya dalam produksi vektor AAV

Terapi gen berkembang pesat, namun biayanya yang tinggi tetap menjadi penghalang utama yang mencegah akses pasien yang lebih luas. Di antara pendorong utama dari biaya ini adalah proses produksi kompleks adeno - vektor virus terkait (AAV). Sebuah studi yang diterbitkan dalam bioteknologi dan bioengineering telah mengembangkan metode pemurnian baru yang menggabungkan filtrasi aliran tangensial (TFF) dengan surfaktan, yang berjanji untuk menyederhanakan proses pemurnian AAV dan mengurangi biaya. Mari kita selidiki penelitian ini yang dipimpin oleh tim dari University of Tokyo.

 

1. Latar Belakang Penelitian: Tantangan dan Status Pemurnian AAV Saat Ini

Vektor AAV telah menjadi alat pengiriman "bintang" dalam terapi gen karena keamanannya yang tinggi, imunogenisitas rendah, kemampuan untuk menginfeksi sel membelah yang membelah dan non-, dan kapasitas untuk ekspresi gen jangka panjang-. Namun, proses produksinya kompleks, terutama langkah -langkah pemurnian hilir, yang biasanya melibatkan beberapa putaran sentrifugasi dan kromatografi. Metode -metode ini adalah waktu - memakan, tenaga kerja - intensif, sulit untuk skala, dan mahal.

Pada skala laboratorium, pemurnian sering bergantung pada cesium klorida atau gradien kepadatan iodixanol Ultracentrifugation, yang menantang skala untuk produksi industri. Kromatografi afinitas semakin banyak digunakan, tetapi kondisi elusi pH rendah yang dibutuhkan dapat mengganggu infektivitas virus. Oleh karena itu, mengembangkan metode pemurnian AAV yang sederhana, efisien, lembut, dan terukur sangat penting.

Tangensial Flow Filtration (TFF) adalah ukuran - teknik pemisahan berbasis yang biasa digunakan untuk berkonsentrasi dan buffer - pertukaran bioproducts. Namun, TFF konvensional memiliki kemampuan terbatas untuk menghilangkan kotoran seperti protein sel inang (HCP) dan DNA selama pemurnian AAV, sering kali meninggalkan agregat protein.

 

2. Pendekatan inovatif: TFF dikombinasikan dengan surfaktan untuk pemurnian yang efisien

To overcome the limitations of traditional TFF, researchers Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa, and colleagues at the University of Tokyo devised a clever strategy: using surfactants to inhibit aggregation and interaction of impurity proteins, allowing them to pass through the TFF ultrafiltration membrane (500 kDa molecular weight cutoff) while retaining AAV viral particles (~25 nm dalam ukuran).

Mereka menguji tiga jenis surfaktan:

• Non - ionic:Octyl glucoside
• Anionik:Sodium deoxycholate
• Zwitterionic:Chaps

Studi ini menemukan bahwa menggunakan surfaktan ionik non - saja tidak efektif. Baik chaps natrium deoksikolat anionik dan zwitterionik secara signifikan meningkatkan penghapusan protein residual, dan mereka menargetkan populasi protein yang berbeda. Pada akhirnya, menggabungkan 0,5% natrium deoxycholate dengan 1% chaps menghasilkan hasil yang luar biasa, hampir sepenuhnya menghilangkan protein inang residual. SDS - analisis halaman hanya menunjukkan tiga pita protein kapsid AAV yang jelas (VP1/VP2/VP3).

 

Gambar 1. Proses pemurnian TFF tanpa surfaktan;(a) sds - halaman elektroforesis gel; (B) Mikroskop elektron transmisi (TEM)

 

Gambar 1. Proses pemurnian TFF dengan surfaktan;(a) SDS - halaman elektroforesis gel; (b) mikroskop elektron transmisi (TEM)

 

3. Hasil Penelitian: Kemurnian, Aktivitas, dan Keselamatan Tinggi

1. Penghapusan pengotor yang efisien:Metode baru mencapai 99,98% penghapusan HCP dan 95% penghapusan DNA, dengan kemurnian yang sebanding dengan atau melebihi kromatografi afinitas.
2. Infektivitas yang lebih baik:Eksperimen in vitro menunjukkan bahwa vektor AAV1 yang dimurnikan menggunakan metode ini sel HEK293 yang terinfeksi lebih efisien daripada yang dimurnikan dengan kromatografi afinitas (24,9% vs 20,8%), menunjukkan pelestarian bioaktivitas virus yang lebih baik.
3. Keselamatan in vivo yang baik:Setelah injeksi lokal dari vektor AAV1 yang dimurnikan ke dalam otot rangka tikus, tidak ada peradangan atau kerusakan jaringan yang signifikan yang diamati setelah dua minggu, menunjukkan keamanan in vivo yang baik.
4. Penerapan serotipe yang luas:Metode ini berhasil memurnikan beberapa serotipe - termasuk AAV1, AAV5, AAV8, dan supernatan kultur sel AAV9-From. Namun, untuk AAV2, yang terutama ada dalam lisat sel dengan beban pengotor tinggi, diperlukan optimasi lebih lanjut.

 

4. Ringkasan dan Outlook

Studi ini mengembangkan proses pemurnian AAV baru yang sederhana, cepat (1,5 jam), efisien, dan terukur. Dengan menggabungkan natrium deoksikolat dan chaps, ia berhasil mengatasi tantangan agregasi protein residual selama pemurnian TFF.

Keuntungan dari metode ini meliputi:

• Menghindari kondisi pH rendah yang keras, lebih baik menjaga aktivitas virus
• Mengurangi langkah -langkah kromatografi, menyederhanakan alur kerja, dan menghemat waktu dan biaya
• Mudah diskalakan, cocok untuk produksi industri besar - skala
• Memberikan strategi baru untuk memurnikan biomacromolekul lainnya seperti eksosom, virus lain, dan antibodi rekombinan

Keterbatasan saat ini meliputi pemulihan virus suboptimal dan ketidakmampuan untuk memisahkan kapsid kosong dari partikel virus penuh, menunjukkan penggunaan terbaiknya mungkin sebagai - langkah pertama dalam alur kerja pemurnian langkah multi-.

Sebagai kesimpulan, penelitian ini menawarkan opsi baru yang menarik untuk produksi vektor AAV hilir dan berpotensi mengurangi biaya obat terapi gen, memfasilitasi aplikasi mereka yang lebih luas.