Penerapan Ultrafiltrasi Dalam Produksi Vaksin Rabies Manusia
Untuk mempromosikan penerapan ultrafiltrasi dalam produksi vaksin rabies manusia, kaset membran ultrafiltrasi 300kDa digunakan untuk mengkonsentrasikan larutan pemanenan virus rabies dan mendeteksi pemulihan antigen, laju penghilangan endotoksin, dan laju penghilangan protein inang setelah ultrafiltrasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada tekanan yang sesuai, larutan pemanen virus rabies dipekatkan 80 kali, dielusi 25 kali, tingkat pemulihan antigen 86,2%, tingkat penghilangan endotoksin bakteri 87,5% ~ 88,7%, dan tingkat penghilangan protein inang adalah 91,6%.
Kata pengantar
Rabies adalah penyakit zoonosis tradisional dan kuno yang disebabkan oleh Virus Rabies (RV), dengan tingkat kematian hingga 100%. Saat ini, tidak ada pengobatan yang efektif untuk pasca pajanan (yaitu kerusakan pada kulit dan selaput lendir) selain vaksin darurat dan vaksinasi imunoglobulin. Sumber utama rabies pada manusia adalah gigitan hewan yang sakit atau berpotensi tertular (terutama anjing). Angka kematian akibat rabies di Tiongkok menempati urutan kedua di dunia, dan rabies merupakan salah satu masalah yang mengancam keamanan kesehatan masyarakat di negara kita. Glikoprotein kapsular virus rabies, yang merupakan satu-satunya antigen kunci yang menginduksi produksi antibodi penetralisir pelindung, telah menjadi fokus penelitian dan pengembangan vaksin baru serta teknologi diagnosis dan pengobatan baru untuk virus rabies.
Virus rabies termasuk dalam genus virus rabies dari keluarga rhabdovirus. Bentuk nukleokapsidnya elastis, nukleokapsidnya simetris heliks, dan permukaannya mempunyai selubung yang mengandung RNA untai tunggal. Patogen itulah yang menyebabkan rabies. Virus rabies memiliki dua antigen utama: satu adalah antigen glikoprotein pada membran luar virus, yang dapat berikatan dengan reseptor asetilkolin untuk membuat virus menjadi neurotoksik, dan menghasilkan antibodi penetralisir dan antibodi penghambat hemaglutinasi dalam tubuh, dan antibodi penetral memiliki efek perlindungan; Yang lainnya adalah antigen riboprotein bagian dalam, yang dapat membuat tubuh memproduksi antibodi pengikat komplemen dan presipitin, dan tidak memiliki efek perlindungan.
Endotoksin merupakan salah satu zat lipopolisakarida (LPS) yang memiliki ketahanan terhadap panas dan kestabilan kimia serta tidak mudah hancur. Jika terdapat konsentrasi endotoksin tertentu pada vaksin maka akan menyebabkan demam parah bahkan kematian setelah vaksinasi, sehingga kandungan endotoksin pada vaksin harus dikurangi semaksimal mungkin. Farmakope Tiongkok edisi 2005 (Bagian III) menetapkan bahwa nilai kontrol indeks kualifikasi endotoksin vaksin rabies tidak boleh lebih tinggi dari 100EU/dosis. Dengan pesatnya perkembangan teknologi pemisahan membran, penerapan teknologi pemisahan membran ultrafiltrasi untuk mengurangi kandungan endotoksin dalam vaksin semakin meluas di industri farmasi.
Vaksin rabies adalah vaksin untuk melawan rabies. Biasanya ada tiga jenis vaksin rabies, termasuk vaksin sel Vero yang dimurnikan, vaksin sel diploid manusia, dan vaksin kultur sel primer. Vaksin rabies dibuat dengan menginokulasi virus tetap virus rabies ke dalam matriks seluler, setelah dikultur, dipanen, dikonsentrasikan, inaktivasi, pemurnian, dan penambahan bahan penstabil yang sesuai. Fungsi utama vaksin rabies adalah merangsang tubuh untuk menghasilkan respon imun yang cepat dan menghasilkan antibodi pelindung terhadap virus rabies, sehingga dapat mencegah infeksi yang disebabkan oleh virus tersebut dan mengurangi risiko penyakit.
Proses produksi vaksin memegang peranan penting dalam menjamin mutu vaksin, apalagi kuantifikasi beberapa indikator dalam proses produksi menjadi lebih penting. Dalam proses produksi vaksin rabies manusia, teknologi konsentrasi ultrafiltrasi merupakan sarana yang diperlukan untuk memproduksi vaksin rabies manusia. Menggunakan membran ultrafiltrasi bukaan yang wajar untuk konsentrasi ultrafiltrasi dapat secara efektif menghilangkan endotoksin dan protein inang, serta mempertahankan antigen RV, yang kondusif untuk produksi vaksin dan peningkatan kualitas. Massa molekul relatif molekul RV adalah 350kDa ~ 460kDa, dan secara teori, RV dapat terperangkap sepenuhnya dengan konsentrasi ultrafiltrasi menggunakan kaset membran dengan berat molekul intersepsi 100kDa dan 300kDa. Endotoksin sering membentuk struktur agregat dalam larutan air yang berbeda, karena derajat agregasi, ukuran molekulnya berbeda. Massa molekul relatif monomer endotoksin adalah 10kDa ~ 20kDa, dan massa molekul relatif bentuk polimerisasinya adalah 300kDa ~ 1000kDa atau lebih dari 1000kDa. Berdasarkan perbedaan berat molekul, antigen RV dalam vaksin rabies manusia dipertahankan dan endotoksin serta protein inang dalam vaksin rabies manusia dihilangkan dengan membran ultrafiltrasi 300kDa.
Dalam percobaan ini, kaset membran ultrafiltrasi dengan bukaan 300kDa dan luas membran 0,11m2 digunakan sebagai perlakuan sampel kecil untuk mengkonsentrasikan produk antara vaksin rabies manusia, dan fluks membran, efisiensi pengobatan, kelipatan konsentrasi, intersepsi antigen, penghilangan endotoksin , dan penghilangan protein inang diuji.
2Metode Bahan
2.1 Bahan percobaan
Virus rabies memperbaiki virus strain CTN-IV; sel Vero; 0,5M natrium hidroksida; Kaset membran ultrafiltrasi 300kDa (bahan PES, luas membran 0,11m²).
2.2 Metode eksperimen
2.2.1 Persiapan larutan pemanen virus
Sel Vero beku diresusitasi dalam air hangat pada suhu 37 derajat ~ 39 derajat, suspensi sel dikeluarkan, dan kemudian ditambahkan ke 199 media kultur yang mengandung 10% serum anak sapi yang tidak aktif. Sel monolayer seragam dikultur pada suhu 37 derajat. Strain CTN-IV diinokulasi dengan virus rabies dengan perbandingan 0.1mol/L dan dikultur pada suhu 37 derajat. Setelah 48 jam, media kultur dibuang dan 199 media kultur yang mengandung 0,1% albumin darah manusia ditambahkan untuk mempertahankan kultur pada suhu 33 derajat ~ 35 derajat. Panen racun penyakit setiap 3 hari sekali, dan gabungkan beberapa cairan pemanenan.
2.2.2 Memasang Kaset Membran
Pasang kaset membran dan sambungkan kabel seperti yang ditunjukkan pada gambar di bawah.
2.2.3 Pencucian Air
Tutup katup masuk, katup balik, dan katup tembus, lalu masukkan ujung balik dan pipa ujung ke dalam tangki cairan limbah. Isi tangki pemasukan dengan 1L air untuk injeksi.
Buka katup masuk dan katup balik, tutup katup tembus, buka pompa, bersihkan saluran balik dengan 10% volume air murni atau air untuk injeksi, dan pertahankan tekanan masuk pada 0,35bar (5psi).
Buka katup filter, tutup katup balik, dan gunakan sisa air injeksi untuk membersihkan pipa filter, pertahankan TMP pada 0.35bar.
2.2.4 Disinfeksi
Tutup katup masuk, katup balik, dan katup transmisi, lalu masukkan saluran balik dan saluran akhir transmisi ke dalam tangki cairan limbah. Isi tangki pemasukan dengan 2L larutan pembersih.
Buka katup masuk dan balik, tutup katup tembus, buka pompa, bersihkan saluran balik dengan 200mL natrium hidroksida 0,5M, dan pertahankan tekanan masuk pada 0,35bar (5psi) .
Buka katup tembus, tutup katup balik, dan bersihkan pipa tembus dengan larutan pembersih bervolume 200mL, pertahankan TMP pada 0,35bar.
Kemudian ujung kembali dan pipa ujung tembus dimasukkan ke dalam tangki cairan untuk pembersihan siklik. Siklus pembersihan dengan 1 ~ 1,5 kali laju aliran tangensial proses selama 30 menit.
Tiriskan 0.5M natrium hidroksida dan bilas dengan air untuk injeksi menurut 2.2.4 sampai netral.
2.2.5 Uji fluks air
Tambahkan air murni ke tangki pemasukan, ukur dan catat suhu air di tangki pemasukan. Masukkan ujung kembali ke dalam tangki. Nyalakan pompa dan sesuaikan kecepatan pompa dan katup balik untuk mencapai perbedaan tekanan transmembran sebesar 0.35bar (5psi). Dengan menggunakan silinder, ukur dan catat laju aliran pada ujung tembus dalam mL/menit. Sesuaikan kecepatan pompa dan katup balik untuk mendapatkan tekanan diferensial transmembran 1bar (15psi). Dengan menggunakan silinder, ukur dan catat laju aliran pada ujung tembus dalam mL/menit.
Untuk membakukan nilai aliran air, bagi nilai aliran air yang dihitung dengan perbedaan tekanan transmembran dan kalikan faktor koreksi suhu pada tabel berikut.
2.2.6 Konsentrasi ultrafiltrasi
Cuci air keluar dari sistem dengan penyangga atas. Siklus selama 5 menit untuk menyesuaikan pH dan stabilitas ion sistem. Jika suhu perlu disesuaikan, lanjutkan siklus hingga suhu sistem stabil.
Tambahkan cairan umpan ke tangki masuk, atur laju aliran umpan (misalnya 400LMH), dan uji laju aliran pada nilai TMP yang berbeda. Berdasarkan data pengujian, kurva digambar dengan TMP sebagai absis dan Fluks sebagai ordinat.
Arahkan pipa ujung-ujung ke dalam wadah atau saluran pembuangan yang sesuai, seperti tangki pengumpul ujung-ujung, tangki limbah cair, dan saluran pembuangan proses.
Catat berat awal cairan umpan di tangki umpan, hidupkan pompa umpan, dan sirkulasikan cairan umpan secara perlahan selama 3 menit hingga 4 menit. Resirkulasi dapat membantu menghilangkan sisa udara pada jalur aliran, sehingga memaksimalkan kinerja film.
Buka katup tembus, naikkan kecepatan pompa secara perlahan hingga laju aliran tangensial optimal tercapai, dan sesuaikan katup balik untuk mencapai TMP sistem yang optimal.
Kemudian masukkan tabung ke dalam wadah pengumpul, mulailah menghitung waktu ketika cairan memasuki wadah, dan catat tekanan masuk dan balik pada interval yang sesuai, dan catat kualitas cairan dari waktu ke waktu di ujung kembali dan ujung tembus untuk menghitung waktu sesaat. laju aliran.
Konsentrasi ultrafiltrasi sampel selesai ketika volume cairan umpan dikurangi ke volume konsentrasi target.
2.2.7 Dialisis
Masukkan pipa intake, pipa pengisian dan pipa kembali ke dalam tangki intake, masukkan pipa transmisi ke dalam wadah pengumpul, dan letakkan wadah pengumpul pada timbangan untuk dibersihkan.
Buka katup balik, hidupkan pompa masuk, buka katup tembus, sesuaikan kecepatan pompa dan TMP ke nilai yang sesuai. Buka pompa pengisian, jaga volume cairan di tangki pemasukan tidak berubah, dan mulai dialisis dengan volume yang sama. Mulailah menghitung waktu ketika cairan memasuki wadah, dan catat tekanan di ujung saluran masuk, ujung kembali, dan massa cairan pada interval waktu yang sesuai, dan dapatkan laju aliran sesaat dengan perhitungan.
2.2.8 CIP
Pertama bilas dengan buffer, lalu bilas dengan air untuk injeksi (operasi 2.2.3), lalu bersihkan dengan bahan pembersih (operasi 2.2.4), dan terakhir bilas dengan air untuk injeksi (operasi 2.2.3).
2.2.9 Uji fluks air
Pengoperasiannya adalah sebagai berikut: 2.4.5.
2.2.10 Pengawetan kaset membran
Penyimpanan jangka pendek (Kurang dari atau sama dengan 3 hari), simpan kaset membran di dalam perlengkapan dan gunakan larutan penyimpanan untuk berputar selama 10 menit hingga 15 menit, tutup katup sistem, putuskan pasokan listrik ke pompa cairan, dan pastikan bahwa tangki saluran masuk cairan tersegel dengan benar.
Jika waktu penyimpanannya adalah 3 hari hingga 1 bulan, harap keluarkan kaset membran dari perlengkapannya dan tutup rapat ke dalam kantong plastik atau wadah kedap udara lainnya. Tambahkan sekitar 50mL hingga 100mL larutan penyimpanan ke dalam kantong plastik atau wadah kedap udara dan tutup rapat. Atau bisa langsung direndam dalam larutan penyimpanan. Tabel berikut merekomendasikan kondisi penyimpanan.
3 Hasil dan analisis
3.1 Investigasi faktor-faktor yang mempengaruhi efisiensi penghilangan pirogen
Tekanan operasi ultrafiltrasi: 15 batch pengujian dijalankan secara terus menerus. Dalam setiap batch, tekanan filtrasi dipertahankan pada 5, 10, 15 dan 2{{10}}psi selama ultrafiltrasi, dan cairan pemanen virus dipekatkan 30 kali dan dielusi dengan cairan buffer (10 kali volume) dalam aliran kontinu. Hasil seperti yang ditunjukkan pada tabel di bawah, tingkat penghilangan endotoksin kurang dari 87,0%, tingkat pemulihan antigen stabil pada 86,0%, dan tingkat penghilangan protein inang stabil pada 90,0%, menunjukkan bahwa tekanan operasi yang berbeda memiliki pengaruh yang kecil terhadap efek pemulihan antigen, penghilangan endotoksin, dan penghilangan protein inang.
Rasio konsentrasi ultrafiltrasi: 15 batch uji dijalankan terus menerus. Dalam setiap batch, cairan pemanenan virus dipekatkan masing-masing 30 kali, 50 kali, 80 kali, dan 100 kali selama ultrafiltrasi. Tekanan filtrasi dipertahankan pada 20psi, dan cairan penyangga (10 kali volume) dielusi dalam aliran kontinu. Hasil seperti terlihat pada tabel berikut, laju penghilangan endotoksin berkisar antara 53,3% hingga 86,9%, laju pemulihan antigen tetap stabil pada 86,0%, dan laju penghilangan protein inang stabil di 91,0%. Dalam pengambilan sampel tersegmentasi, tidak ada antigen yang terdeteksi dalam larutan transmisi, dan kurang dari 10% protein inang yang tersisa dalam larutan virus pekat. Konsentrasi endotoksin dalam larutan pekat virus meningkat seiring bertambahnya waktu konsentrasi, dan laju penghilangan endotoksin adalah yang tertinggi pada sampel pekat sebanyak 80 kali lipat, dan pabrikan juga dapat mempertimbangkan konsentrasi 100 kali lipat, yang tidak hanya meningkatkan efisiensi produksi dan mengurangi biaya, tetapi juga memenuhi persyaratan produksi vaksin.
3.2 Penipisan fluks kaset membran dan regenerasi pembersihan
Setelah perawatan, tingkat pemulihan fluks membran adalah 92,6%. Tingkat pemulihan pertama dari kaset membran baru adalah normal, sesuai dengan sifat pengamatan cairan umpan saat ini, prediksi selanjutnya dari waktu kedua dan NTH, tingkat pemulihan fluks kaset membran akan mendekati data setelah perawatan ini, dan cenderung stabil. Dalam waktu 2 jam sekali penggunaan, penipisan kaset membran sudah ideal, dan hanya 10% fluks membran yang terkuras pada keseluruhan pengoperasian.
3.2.1 Penipisan fluks dalam proses perawatan kaset membran
3.2.2 Hasil pembersihan dan regenerasi kaset membran
Tentang Panduan
Guidling Technology adalah perusahaan teknologi tinggi nasional yang berfokus pada biofarmasi, kultur sel, pemurnian dan konsentrasi biomedis, diagnosis, dan cairan industri. Kami telah berhasil mengembangkan perangkat filter sentrifugal, kaset ultrafiltrasi & mikrofiltrasi, filter virus, sistem TFF, filter kedalaman, serat berongga, dll. Yang sepenuhnya memenuhi skenario penerapan biofarmasi, kultur sel, dan sebagainya. Membran dan filter membran kami banyak digunakan dalam konsentrasi, ekstraksi dan pemisahan pra-filtrasi, mikrofiltrasi, ultrafiltrasi, dan nanofiltrasi. Berbagai lini produk kami, mulai dari filtrasi laboratorium kecil sekali pakai hingga sistem filtrasi produksi, pengujian sterilitas, fermentasi, kultur sel, dan banyak lagi, memenuhi kebutuhan pengujian dan produksi. Guidling Technology berharap dapat bekerja sama dengan Anda!
