Tindakan pencegahan untuk penggunaan tabung ultrafiltrasi
(1) Pilih tabung ultrafiltrasi yang sesuai. Umumnya, berat molekul yang akan dipertahankan tidak boleh lebih besar dari 1/3 dari berat molekul protein target. Misalnya, jika berat molekul protein target adalah 35kDa, tabung ultrafiltrasi dengan berat molekul 10kDa dapat dipilih. Jika berat molekul protein target adalah sekitar 10kd, tabung ultrafiltrasi dengan berat molekul 3KD dapat digunakan. Baca manual instruksi dengan cermat dan perhatikan toleransi yang berbeda dari membran ultrafiltrasi terhadap berbagai bahan kimia.
(2) Ultrafiltrasi yang baru dibeli kering. Tambahkan air ultrapure sebelum digunakan, dan air akan sepenuhnya melewati membran. Dinginkan dalam bak es atau kulkas selama beberapa menit. Kemudian tuangkan air dan tambahkan larutan protein. Jumlah yang ditambahkan tidak boleh melebihi garis putih di bagian atas tabung. Operasi harus ringan. Sebelum menambahkan larutan protein, tabung ultrafiltrasi perlu dimasukkan ke dalam es untuk precooling.
(3) Keseimbangan. Massa dan pusat gravitasi harus seimbang. Perhatikan bahwa kecepatan dan akselerasi tidak boleh terlalu cepat, jika tidak membran ultrafiltrasi akan langsung rusak. Mulai ultrafiltrasi sentrifugal (centrifuge precooling hingga 4 derajat). Setelah RPM sentrifugal yang berbeda diubah menjadi G, itu berbeda. Sesuaikan percepatan centrifuge ke gigi terendah untuk mengurangi tekanan pada membran. Perhatikan bahwa Anda harus menunggu sampai sentrifugal mencapai kecepatan target sebelum meninggalkan sentrifugal, jika tidak ketika ada masalah dengan centrifuge, Anda tidak dapat menghadapinya pada saat pertama. Arah membran dan poros yang berputar harus disesuaikan sesuai dengan instruksi (dalam kasus sentrifugal berputar sudut, membran tegak lurus terhadap poros). Dalam penggunaan praktis, kecepatan umumnya lebih rendah daripada dalam manual, yang dapat memperpanjang masa pakai pipa sentrifugal.
(4) Ketika terkonsentrasi ke 1ml yang tersisa, ambil larutan buffer 50ul dan tambahkan 10ul untuk mengalir untuk melihat apakah berubah menjadi biru, untuk menilai apakah tabung ultrafiltrasi membocorkan protein. Jika tabung bocor, tuangkan lapisan atas dan mengalir melalui tabung baru dan mulai ultrafiltrasi. Untuk menilai secara akurat apakah tabung bocor, centrifuge dengan 5mgml BSA selama 10 menit, kemudian ambil aliran melalui, jalankan lem protein atau Bradford untuk pengukuran kasar, dan terus menambahkan larutan protein yang tersisa untuk konsentrasi (beroperasi pada es untuk mencegah protein dipanaskan) sampai semua larutan terkonsentrasi ditambahkan. Perhatikan apakah presipitasi protein terjadi selama sentrifugasi, yang mengakibatkan penyumbatan pipa. Jika curah hujan terjadi, tentukan penyebab spesifik presipitasi, apakah konsentrasi protein terlalu tinggi atau buffer tidak sesuai; Yang pertama dapat diselesaikan dengan ultrafiltrasi simultan dengan beberapa tabung ultrafiltrasi untuk mengurangi konsentrasi. Yang terakhir adalah mengubah larutan buffer yang berbeda sampai protein tidak mengendap.
(5) Langkah-langkah sebelumnya digunakan untuk memusatkan protein. Jika Anda ingin mengubah buffer, ketika larutan protein total terkonsentrasi menjadi sekitar 1ml, tambahkan buffer baru dengan lembut (ultrafiltrasi melalui membran ultrafiltrasi 0,22um), dan kemudian berkonsentrasi sekitar 1ml selama tiga kali berturut-turut. Volume akhir konsentrasi terakhir tergantung pada konsentrasi protein yang diperlukan, yang umumnya tidak lebih dari 500ul, atau dapat terkonsentrasi hingga kurang dari 200ul. Menurut konsentrasi volume setidaknya 10 kali setiap kali, dapat mencapai lebih dari 1000 kali tiga kali, yang pada dasarnya dapat mencapai tujuan mengubah buffer.
