Cara Memilih Tabung Ultrafiltrasi yang Tepat
Tabung ultrafiltrasi yang biasa digunakan untuk konsentrasi protein dan penggantian buffer sering digunakan dalam tabung ultrafiltrasi. Ada model lain, yang memiliki ukuran volume dan tabung ultrafiltrasi yang berbeda, tergantung pada berat molekul protein target, volume sebelum konsentrasi dan volume target konsentrasi. Dapat digunakan kembali.
1. Pilih tabung ultrafiltrasi yang sesuai, terutama mempertimbangkan MWCO dan volume konsentrasi. Umumnya, berat molekul tidak boleh lebih besar dari 1/3 dari berat molekul protein target. Jika berat molekul protein target sekitar 10 kd, tabung ultrafiltrasi dengan berat molekul tertahan 3 KD dapat digunakan.
2. Ultrafiltrasi yang baru dibeli sudah kering. Tambahkan air miliq sebelum digunakan. Air melewati sepenuhnya melalui membran dan didinginkan terlebih dahulu dalam penangas es atau lemari es selama beberapa menit. Kemudian tuangkan air untuk menambahkan larutan protein. Jumlah larutan protein tidak boleh melebihi garis putih di bagian atas tabung reaksi. Pengoperasian yang mudah. Sebelum menambahkan larutan protein, tabung ultrafiltrasi perlu dimasukkan ke dalam es untuk pendinginan awal.
3. Saldo. Massa dan pusat gravitasi harus seimbang. Perhatikan bahwa kecepatan dan akselerasi tidak boleh terlalu cepat, jika tidak, membran ultrafiltrasi akan langsung rusak. Mulai ultrafiltrasi sentrifugal (pendinginkan sentrifugal hingga 4 derajat). Arah diafragma dan poros yang berputar dapat disesuaikan sesuai dengan instruksi (dalam hal sentrifugal sudut, diafragma tegak lurus terhadap poros). Dalam penggunaan sebenarnya, kecepatan umum lebih rendah dari yang ditentukan dalam manual, yang dapat memperpanjang masa pakai pipa sentrifugal.
4. ketika terkonsentrasi ke 1ml tersisa, [ambil larutan Bradford rumah tangga 50ul, tambahkan cairan 10ul untuk melihat apakah warnanya menjadi biru, dan tentukan apakah tabung ultrafiltrasi membocorkan protein. Jika tabung bocor, tuangkan ke lapisan atas dan kemudian mengalir kembali ke tabung baru untuk memulai ultrafiltrasi. Untuk menentukan secara akurat apakah tabung reaksi bocor, silakan 5mg 10min centrifuge 10min, lalu lewati, jalankan gel protein atau Bradford] [pengukuran kasar]. Lanjutkan menambahkan sisa larutan protein ke dalam konsentrat (operasikan di atas es untuk mencegah pemanasan protein) sampai semua larutan pekat ditambahkan. Selama sentrifugasi, perhatikan apakah terjadi pengendapan protein dan menyebabkan penyumbatan tabung. Jika terjadi presipitasi, harap tentukan penyebab spesifik presipitasi, apakah konsentrasi protein terlalu tinggi atau buffer tidak sesuai; Yang pertama dapat diselesaikan dengan menggunakan beberapa tabung ultrafiltrasi pada saat yang sama untuk mengurangi konsentrasi, sedangkan yang kedua dapat mengubah buffer yang berbeda sampai protein mengendap.
5. Langkah-langkah sebelumnya digunakan untuk mengkonsentrasikan protein. Jika buffer akan diganti, ketika larutan protein total dipekatkan menjadi sekitar 1ml, tambahkan buffer baru secara perlahan (ultrafiltrasi melalui 0.22um membran ultrafiltrasi), dan kemudian konsentrat terus menerus hingga sekitar 1ml selama tiga kali, jadi bahwa konsentrasi akhir tergantung pada konsentrasi protein yang dibutuhkan, yang biasanya tidak lebih dari 500ul atau kurang dari 200ul. Menurut konsentrasi volume setidaknya 10 kali setiap kali, itu lebih dari 1000 kali lipat dari tiga kali, yang pada dasarnya dapat mencapai tujuan mengubah buffer.
6. Buang konsentrat protein akhir. Beroperasi di atas es. Dengan menggunakan ujung pipet berwarna kuning (200ul), masukkan ujung pipet secara perlahan di sepanjang tepinya, lalu tiup perlahan dan campur larutan protein. Hati-hati jangan sampai menyentuh membran ultrafiltrasi. Sedot larutan pekat hingga 200ul setiap kali sampai benar-benar tersedot. Tidak perlu mengekstrak larutan pekat terakhir di bagian bawah tabung reaksi, jika tidak terlalu sulit dan membran ultrafiltrasi dapat rusak. Terakhir, air miliq ditambahkan ke dalam tabung ultrafiltrasi tanpa melewati membran ultrafiltrasi untuk mencegah hilangnya air dan pengeringan membran.
7. Berikut ini adalah langkah-langkah perawatan tabung ultrafiltrasi dan penggunaan kembali tabung ultrafiltrasi.
8. Tuang air ke dalam tabung ultrafiltrasi dan bilas perlahan dengan air miliq beberapa kali. [jika ada pengendapan protein yang jelas di bagian bawah tabung reaksi, Anda dapat menambahkan air terlebih dahulu dan kemudian meniupnya dengan pipet. Hati-hati jangan sampai menyentuh membran. Sedimen menggantung dan kemudian melarikan diri. Anda tidak bisa menyiramnya dengan air keran. Setelah menambahkan 0.2m larutan NaOH, letakkan pada suhu kamar selama 20 menit, dan seimbangkan tabung ultrafiltrasi selama periode ini. Centrifuge selama 10 menit lagi. Tuang sisa larutan NaOH dan rendam inti kapas ke dalam gelas kimia (1 atau 2L) Milliq water, didiamkan selama beberapa jam, lalu diganti dengan air baru, didiamkan selama beberapa jam untuk terus mengencerkan konsentrasi NaOH. Cuci tabung reaksi 50ml dan tutup dengan air keran, dan cuci dinding bagian dalam dengan air miliq.
9. Keluarkan inti tabung reaksi yang terendam, tambahkan air miliq penuh, lalu isi tabung reaksi 50ml dengan air miliq. Perlahan masukkan inti tabung ke dalam 50ml.
Tabung sentrifus, tiriskan dan bagi air, lalu tutup dan simpan pada suhu 4 derajat hingga penggunaan berikutnya. Secara umum, menurut langkah-langkah dan tindakan pencegahan di atas, setiap tabung tidak akan pecah dalam waktu tiga atau empat tahun.
