Kajian Proses Klarifikasi Lisat Fermentasi Kepadatan Tinggi Escherichia Coli Rekombinan

 

Untuk mengurangi gangguan cairan material terhadap kromatografi dan meningkatkan perolehan protein target, proses klarifikasi lisat fermentasi kepadatan tinggi dari dua strain Escherichia coli rekombinan dipelajari. Strain BL21-HP1036 dan BL21-palA yang mengekspresikan gen kunci Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis dipilih. Proses aliran tangensial, proses sentrifugasi kecepatan tinggi dan proses klarifikasi kaset membran digunakan untuk mengevaluasi hasil protein melalui deteksi kekeruhan dan elektroforesis.

 

Hasilnya menunjukkan bahwa lisat fermentasi kepadatan tinggi BL21-HP1036, BL21-palA yang mengekspresikan gen kunci Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis diklarifikasi dengan filtrasi dan sentrifugasi kaset membran, dan hasil protein lebih dari 80%, yang secara efektif dapat mengurangi gangguan kromatografi dan meningkatkan tingkat pemulihan.

 

Perkenalan

Saat ini, Streptococcus suis (SS) dan Haemophilus parasuis (HPS) merupakan bakteri patogen penyakit yang paling umum di peternakan babi, yang membawa kerugian besar bagi industri babi. SS dapat dibagi menjadi total 35 serotipe 1-34 dan 1/2, dan HPS dapat dibagi menjadi 1-15 serotipe, dan keduanya sering bercampur, terutama menyebabkan poliserositis babi, radang sendi, meningitis, endokarditis , septikemia bakterial dan bronkitis.

 

Karena banyaknya serotipe Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis, perlindungan silang antara serotipe yang berbeda menjadi lemah, dan resistensi antibiotik akan meningkat secara signifikan bila diobati dengan antibiotik, yang akan mempengaruhi efek terapeutik.

 

Vaksin menjadi salah satu cara efektif untuk mencegah SS dan HPS. Ada vaksin yang tidak aktif, vaksin yang dilemahkan, vaksin hidup, vaksin subunit dan vaksin rekayasa genetika, tetapi vaksin yang tidak aktif dan vaksin yang dilemahkan sebagian besar ada di pasaran, dan perlindungan kekebalannya baik, tetapi perlindungan silangnya tidak jelas. Vaksin subunit merupakan vaksin jenis baru terhadap streptococcus suis, yaitu vaksin jenis baru dengan perlindungan silang yang kuat dan harga yang murah. Penelitian dan pengembangan vaksin subunit Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis memberikan solusi tepat untuk masalah pencegahan dan pengendalian Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis yang mengganggu industri babi di Tiongkok.

 

Vaksin subunit Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis mengalami fermentasi kepadatan tinggi oleh Escherichia coli rekombinan. Klarifikasi lisat mempunyai pengaruh yang besar terhadap hasil protein target, namun hanya ada sedikit laporan yang relevan. Bagaimana mewujudkan langkah klarifikasi proses fermentasi dan pemurnian merupakan pekerjaan penting. Dalam makalah ini, fermentasi kepadatan tinggi E. coli BL21-HP1036, BL21-palA rekombinan sebagai objek, untuk mempelajari cara mengurangi kekeruhan larutan klarifikasi secara efisien, meningkatkan hasil protein, misalnya Proses fermentasi vaksin subunit Streptococcus suis untuk mencapai teknologi penghancuran dan klarifikasi industri untuk memberikan landasan teori dan dukungan teknis.

 

1. Bahan dan metode

1.1 Bahan

 

1.1.1 Strain

Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis strain BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Media utama dan reagen

Ekstrak ragi dan lumba-lumba; natrium klorida; Kanamisin, IPTG; Formaldehida dari; Paket gel SDS-PAGE.

 

1.1.3 Alat uji utama

fermentor dengan kepadatan tinggi; Mesin sentrifugal berkecepatan tinggi; Peralatan elektroforesis; Sistem pencitraan gel ultraviolet; Penghancur ultrasonik; Centrifuge kecepatan tinggi kecil; Spektrofotometer ultraviolet; Meja pengocok suhu konstan; Peralatan kromatografi afinitas.

 

1.2 Metode

 

1.2.1 Kultur fermentasi kepadatan tinggi

Strain koliform rekombinan yang memenuhi syarat BL21-HP1036 dan BL21-pa-lA diinokulasi pada media sintetik pada 2%(V/V) dan dikultur pada suhu 37 derajat selama 35-40 jam.

 

1.2.2 Ekspresi yang diinduksi protein rekombinan

Ketika larutan fermentasi OD{{0}}±0.1, induksi dimulai, suhu induksi adalah 35 derajat ±0,5 derajat, dan kultur berakhir setelah 10 jam induksi.

 

1.2.3 Penghancuran dan sentrifugasi homogen bertekanan tinggi

Cairan bakteri yang lolos uji inaktivasi dihancurkan dengan homogenizer bertekanan tinggi untuk perengkahan sel masing-masing, dengan tekanan 100~150 MPa. Setelah dihancurkan, cairan yang dihancurkan disimpan pada suhu rendah.

Supernatan diperoleh dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan tinggi, kecepatan sentrifugal: 15000 rpm, pengatur suhu :10 derajat ~15 derajat , kecepatan injeksi :0,5~1 L/mnt, masing-masing supernatan dikumpulkan, dan supernatan diisi dengan wadah yang menghilangkan endotoksin.

 

1.2.4 Klarifikasi kaset membran mikrofiltrasi

Membran dicuci dengan 10L air murni dalam satu arah, dan dilakukan penyaringan aliran tangensial. 300 mL suspensi bakteri yang rusak setelah sentrifugasi diambil dari pipa centrifuge dan diklarifikasi dengan kaset membran mikrofiltrasi 0,45um. Kekeruhan diukur dengan pengambilan sampel masing-masing, dan kekeruhan setelah sentrifugasi, kekeruhan cairan yang diklarifikasi dalam kaset membran mikrofiltrasi dan kekeruhan cairan pekat dalam kaset membran mikrofiltrasi dibandingkan. Kandungan protein sampel dideteksi dengan kromatografi dan elektroforesis untuk mengevaluasi hasil protein.

 

Langkah 2: Hasil

2.1 Klarifikasi data dan hasil pengujian protein BL21-HP1036 dan BL21-palA

Hasil pada Gambar. Gambar 1 menunjukkan bahwa kekeruhan cairan penghancur Escherichia coli rekombinan BL21-HP1036 dan BL21-palA menurun masing-masing dari 4 500 NTU dan 4 000 NTU menjadi 1970 NTU dan 520 NTU, setelah sentrifugasi tabung. Kekeruhan Escherichia coli rekombinan BL21-HP1036 dan BL21-palA diturunkan menjadi 25 NTU dan 1,28 NTU dengan metode kaset membran mikrofiltrasi. Dapat dilihat bahwa penggunaan filtrasi aliran tangensial kaset membran mikrofiltrasi dan saluran aliran terbuka yang dioptimalkan memiliki efek yang baik dalam mengurangi endotoksin, viskositas dan kekeruhan cairan kromatografi dibandingkan filtrasi sentrifugasi tradisional, dan secara signifikan dapat mengurangi heteroprotein E. coli rekombinan yang rusak dan asam nukleat.

 

2.2 Pemulihan protein sampel BL21-HP1036 dan BL21-palA

Tabel 1 menunjukkan bahwa protein Escherichia coli BL21-HP1036 rekombinan ada dalam larutan klarifikasi mikrofiltrasi dan supernatan pekat yang ditutupi oleh membran mikrofiltrasi, dan total hasil protein setelah memperoleh kembali protein dari larutan klarifikasi mikrofiltrasi dan supernatan pekat adalah sekitar 88,5%. Protein BL21-palA juga ada dalam larutan klarifikasi eksudat mikrofiltrasi dan supernatan larutan pekat yang ditutupi oleh kaset membran mikrofiltrasi. Hasil total protein BL21-PALa adalah 81,5%.

 

3. Kesimpulan

Dalam tulisan ini, strain yang mengekspresikan gen kunci BL{{0}}HP1036 dan BL21-palA dari Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis masing-masing menjalani fermentasi kepadatan tinggi dan melewati 0,45 Kekeruhan cairan material adalah dikurangi secara signifikan oleh proses kaset membran mikrofiltrasi um, menunjukkan bahwa teknologi filtrasi aliran tangensial dengan kaset membran mikrofiltrasi lebih baik dibandingkan dengan centrifuge berkecepatan tinggi, dan dapat secara signifikan mengurangi protein pengotor dan asam nukleat dari Escherichia coli rekombinan yang rusak.

 

Setelah mengumpulkan cairan bening dalam kaset membran mikrofiltrasi tunggal, terdapat 62,9% Karena 37,1% dari protein target BL21-HP1036 adalah konsentrat mikrofiltrasi atau ada dalam kaset membran mikrofiltrasi dan kehilangan lainnya , metode dua langkah diadopsi untuk klarifikasi. Pada langkah pertama, kaset membran mikrofiltrasi 0,45um digunakan untuk memperjelas dan mengumpulkan eksudat; pada langkah kedua, sisa cairan pekat dikumpulkan setelah sentrifugasi tabung, dan cairan klarifikasi dua langkah digabungkan sebagai sampel kromatografi. Nilai kekeruhan cairan fermentasi BL21-palA tidak meningkat secara signifikan, rendemen protein dapat mencapai lebih dari 85,5%, dan hasil protein cairan fermentasi BL21-Pala dapat mencapai 81,5% setelah perlakuan dua langkah.

 

Mengenai cara memilih kaset membran mikrofiltrasi, Teknologi Guidling dapat memberi Anda solusi berkualitas tinggi. Produk seri kaset membran mikrofiltrasi dan kaset membran ultrafiltrasi kami menggunakan polieter sulfon sebagai pembawa, yang dirancang khusus untuk bioteknologi. Membran polieter sulfon kami memiliki keunggulan throughput tinggi, adsorpsi protein rendah, kekuatan mekanik tinggi, ketahanan benturan dan sebagainya. Kami memberi Anda klem membran khusus untuk mengukur tekanan saluran masuk dan keluar secara real time, dan dapat memberikan kunjungan teknis sesuai dengan kebutuhan Anda untuk menyesuaikan sistem ultrafiltrasi/mikrofiltrasi khusus Anda. Sistem aliran tangensial kecil seperti itu dapat digunakan untuk produksi kecil, percontohan dan skala kecil, dan dapat berupa amplifikasi linier sepenuhnya untuk sepenuhnya memenuhi persyaratan pengujian dan persyaratan produksi Anda.

Tentang Panduan

Guidling Technology adalah perusahaan teknologi tinggi nasional yang berfokus pada biofarmasi, kultur sel, pemurnian dan konsentrasi biomedis, diagnosis, dan cairan industri. Kami telah berhasil mengembangkan perangkat filter sentrifugal, kaset ultrafiltrasi & mikrofiltrasi, filter virus, sistem TFF, filter kedalaman, serat berongga, dll. Yang sepenuhnya memenuhi skenario penerapan biofarmasi, kultur sel, dan sebagainya. Membran dan filter membran kami banyak digunakan dalam konsentrasi, ekstraksi dan pemisahan pra-filtrasi, mikrofiltrasi, ultrafiltrasi, dan nanofiltrasi. Berbagai lini produk kami, mulai dari filtrasi laboratorium kecil sekali pakai hingga sistem filtrasi produksi, pengujian sterilitas, fermentasi, kultur sel, dan banyak lagi, memenuhi kebutuhan pengujian dan produksi. Guidling Technology berharap dapat bekerja sama dengan Anda!